Pierwsze kroki z MISSION^® shRNA

Czytaj więcej

Dlaczego warto wybrać shRNA?
Używanie kontroli
Startowanie z bakteryjnymi stockami glicerolowymi
Startowanie z oczyszczonym plazmidowym DNA
Rozpoczynanie z Lentiwirusowymi Cząsteczkami Transdukcyjnymi
Zamawianie po raz pierwszy
Słowniczek RNAi
Więcej pomocy

Dlaczego warto wybrać shRNA?

Wyciszanie genów i knockdown przy użyciu interferencji RNA staje się rutyną. Wprowadzenie małych interferujących RNA (siRNA) do hodowanych komórek zapewnia szybki i skuteczny sposób na obniżenie ekspresji genów i pozwoliło siRNA szybko stać się wszechobecnym narzędziem w biologii molekularnej. Wykazano, że siRNA jest skuteczny w krótkotrwałym hamowaniu genów w niektórych transformowanych liniach komórkowych ssaków, podczas gdy shRNA oferuje możliwość silnego i stabilnego wyciszenia ekspresji genów.

Długoterminowe, stabilne wyciszanie genów odróżnia konstrukty RNA z krótką spinką do włosów (shRNA) od innych narzędzi RNAi. W przypadku genów o powolnym lub potencjalnie powolnym obrocie, wykorzystanie shRNA do długotrwałego wyciszania jest nie tylko wygodą, ale jedynym wyborem. W przypadku tych białek siRNA może zostać rozcieńczone, zanim komórka zdąży skutecznie zdegradować mRNA. Długotrwałe wyciszanie genów można osiągnąć za pomocą standardowych metod selekcji klonalnej przy użyciu plazmidu pLKO.1, a następnie selekcji puromycyną. Zespół MISSION^® bioproduction może zapewnić znacznie bardziej skuteczne i mniej stronnicze rozwiązanie niż selekcja klonalna, lentiwirusowe dostarczanie shRNA MISSION^® TRC (co to jest TRC?) konstruktów lentiwirusowych shRNA może z łatwością transdukować typowo trudne linie komórkowe, takie jak komórki pierwotne i nie dzielące się komórki oraz łatwo zintegrować shRNA z genomem tych komórek w celu stabilnego wyciszenia genów.

We gwarancja przy zakupie zdefiniowanej ilości zestawu klonów na stronie szczegółów shRNA dla interesującego genu (jest ona różna, ale zazwyczaj wynosi 5 klonów), że co najmniej jeden z tych klonów dla genu powinien dać więcej niż 70% knockdown.

Przeglądaj dane aplikacyjne od naszego zespołu ds. badań i rozwoju, a także od niezależnych badaczy.

Używanie kontroli

.Podczas przeprowadzania eksperymentów z użyciem konstruktów shRNA MISSION^® TRC, właściwe kontrole powinny być kluczowym elementem projektu eksperymentalnego, aby umożliwić dokładną interpretację wyników knockdown. Wszystkie kontrole są dostępne zarówno w formacie oczyszczonego plazmidowego DNA, jak i cząsteczek lentiwirusowych.

Dodatkowo, MISSION^® TurboGFP™ Control Transduction Particles (SHC003V) mogą służyć do optymalizacji wydajności transdukcji przy pierwszym użyciu linii komórkowej.

Zalecane przez nas kontrole dla każdego eksperymentu shRNA znajdują się na stronie kontrole shRNA i są ściśle dostosowane do kontroli sugerowanych w artykule redakcyjnym Nature Cell Biology.¹

Odniesienie:

1. Whither RNAi? Nature Cell Biology. 5(2003):489-490.

.Zaczynając od zapasów glicerolu bakteryjnego

MISSION^® TRC shRNA Bacterial Glycerol Stocks oferują odnawialne zasoby dla konstruktów shRNA. Wektory mogą być używane bezpośrednio do przejściowej lub stabilnej transfekcji lub używane z plazmidami pakującymi do produkcji lentiwirusowych cząstek transdukcyjnych.

Odwiedź stronę mapa wektorów na stronie

MISSION^® SHRNA Bacterial Glycerol Stock Technical Bulletin (PDF)

Rozwiązywanie problemów:

Problem	Przyczyna	Rozwiązanie
Brak wzrostu kultury bakteryjnej na płytkach selekcyjnych	Nieprawidłowe stężenie karbenicyliny	Sprawdź ponownie stężenie karbenicyliny lub wylej świeże płytki zawierające 100 µg/ml karbenicyliny.
	Niewystarczająca objętość inokulum z zamrożonej hodowli	Usuń większą objętość hodowli z zamrożonego glicerolu.
	Niewystarczająca temperatura przechowywania zamrożonej kultury	Temperatura przechowywania musi wynosić -70 °C lub mniej. Uzyskaj nowe zapasy.
	Wielokrotne cykle zamrażania-rozmrażania	Unikaj zamrażania-rozmrażania kultury więcej niż 2 razy.
Niska wydajność plazmidów	Trudny konstrukt	Przeprowadź większe oczyszczanie (midi lub maxi preps) na konstruktach, które dają niską wydajność.
	Nieudane użycie pojedynczej kolonii do inokulacji	Użyj wyizolowanej kolonii do inokulacji kultur w celu przygotowania DNA.

Starting with Purified Plasmid DNA

MISSION^® TRC shRNA purified plasmid DNA format eliminuje kłopoty związane z przygotowaniem DNA z każdego konstruktu. DNA może być używane bezpośrednio do przejściowej lub stabilnej transfekcji lub z plazmidami pakującymi w pakującej linii komórkowej do produkcji cząstek lentiwirusowych. Każdy konstrukt zawiera 1 µg DNA.

Odwiedź stronę Mapa wektorowa strona

MISSION^® shRNA Plasmid DNA Technical Bulletin (PDF)

MISSION^® TRC shRNA oczyszczone konstrukty plazmidowego DNA są kompatybilne z większością dostępnych na rynku odczynników do transfekcji. Niektóre linie komórkowe mogą być bardziej wrażliwe/odporne na transfekcję niż inne. Wydajność transfekcji można zoptymalizować przy użyciu wektora kontrolnego TurboGFP MISSION^® TurboGFP Control Vector (SHC003).

Oferujemy szeroką gamę odczynników do transfekcji które obejmują wiele typów komórek.

Starting with Lentiviral Transduction Particles

MISSION^® TRC shRNA lentiwirusowy format cząsteczek transdukcyjnych oferuje najwyższą wygodę. Cząsteczki transdukcyjne są gotowe do dodania bezpośrednio do komórek. Praktycznie każda linia komórek ssaków może być transdukowana, w tym komórki pierwotne i nie dzielące się.

Wyniki wysokoprzepustowej produkcji cząstek lentiwirusowych

MISSION^® shRNA Lentiviral Transduction Particles Technical Bulletin (PDF) 

Wybór cząsteczek do transdukcji lentiwirusowej.

Wybór linii komórkowej

Cząsteczki lentiwirusowe MISSION^® TRC są pseudotypowane białkiem otoczki VSV-G. Pozwala to na skuteczną transdukcję cząstek lentiwirusowych zawierających shRNA do większości linii komórkowych ssaków. Zaleca się, aby podczas pracy z linią komórkową po raz pierwszy zoptymalizować ilość cząstek lentiwirusowych potrzebnych do transdukcji przy użyciu MISSION^® TurboGFP Control Transduction Particles (SHC003V). Ta niezbędna kontrola pozytywna wyraża TurboGFP, marker zielonego białka fluorescencyjnego, który może być wykorzystywany do monitorowania projektu eksperymentalnego i pomaga w interpretacji wyników. Transdukcję można dodatkowo wzmocnić za pomocą systemu ExpressMag^® transduction system. System ten wykorzystuje połączenie nanocząsteczek i silnych magnesów ziem rzadkich w celu zwiększenia wydajności transdukcji lentiwirusów.

Czy twoja linia komórkowa została zwalidowana pod kątem transdukcji lentiwirusowej?

Wybór testu

Ważne jest określenie testu, który zostanie przeprowadzony w celu oceny ekspresji genu docelowego i knockdown. Do określenia poziomu transkryptu mRNA, poziomu białka lub odpowiedzi fenotypowej można użyć różnych testów. Podczas określania testu należy pamiętać, że knockdown istotnych genów może być śmiertelny dla komórek i wpływać na rodzaj wykonywanego testu.

mRNA Transcript Assays

Protein Assays
Western Blotting

Phenotypic Assays
Cancer Markers
Cell Viability and Proliferation
Cell Signaling

Multiplicity of Infection (MOI)

Multiplicity of Infection to liczba transdukujących cząstek lentiwirusowych na komórkę. Zaleca się, aby dla każdego nowego typu komórek, które mają być transdukowane, przetestować zakres MOI. MOI można regulować poprzez zwiększanie/zmniejszanie liczby komórek na studzienkę lub zwiększanie/zmniejszanie ilości supernatantu dodawanego do studzienki. Pozwoli to określić optymalną ilość supernatantu lentiwirusowego potrzebną do skutecznej transdukcji każdej używanej linii komórkowej. Zalecamy przetestowanie MOI na poziomie .5, 1, 2 i 5.

Aby obliczyć:

(całkowita liczba komórek na studzienkę) x (pożądane MOI) = całkowita liczba potrzebnych jednostek transdukujących (TU)

(Całkowita potrzebna TU) / (TU/mL podana na C of A) = Całkowita ilość mL cząstek lentiwirusowych do dodania do każdego dołka

Puromycin Titration (when using selection)

Puromycin titration (kill curve) should be performed when working with a new cell type.

1. Nałóż 1,6 x 10⁴ komórek do studzienek 96-dołkowej płytki z 120 µL świeżej pożywki.
2. Następnego dnia dodaj 500-10,000 ng/ml puromycyny do wybranych dołków.
3. Badaj żywotność co 2 dni.
4. Hoduj przez 10-14 dni. Wymieniaj pożywkę zawierającą puromycynę co 3 dni.
5. Minimalne stężenie puromycyny, które powoduje całkowitą śmierć komórek po 3-5 dniach, powinno być stosowane dla tego typu komórek.

Posiadamy listę przydatnych protokołów shRNA dostępnych dla każdego na protokoły strona internetowa.

Zamawianie po raz pierwszy

Biblioteka MISSION^® TRC shRNA jest dostępna do zamawiania online. Najpierw należy utworzyć swój profil online i zaznaczyć pole "Poproś o dostęp do zamówień internetowych" w formularzu. Po utworzeniu i zweryfikowaniu profilu będzie można dodać klony do koszyka zamówień.

Więcej pomocy

Centrum pytań

Email missionrnai@milliporesigma.com aby uzyskać więcej pomocy.

Obsługa techniczna

Kontakt

W przypadku pytań dotyczących biblioteki, cen i ofert lub innych wątpliwości, prosimy o e-mail na adres: missionrnai@milliporesigma.com.

MISSION jest znakiem towarowym firmy Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy i/lub jej podmiotów stowarzyszonych. Wszystkie inne znaki towarowe są własnością ich odpowiednich właścicieli. Szczegółowe informacje na temat znaków towarowych są dostępne za pośrednictwem publicznie dostępnych zasobów. Licencja na znak towarowy.