Protokół hodowli komórkowej 5: Subkultura zawiesinowych linii komórkowych

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Aim

Ogólnie rzecz biorąc,  linie komórkowe pochodzące z krwi (np. limfocyty) rosną w hodowlach zawiesinowych. Komórki mogą rosnąć jako pojedyncze komórki lub w skupiskach (np. linie komórek limfoblastycznych transformowanych wirusem EBV). W przypadku tego typu linii komórkowych podhodowla przez rozcieńczenie jest stosunkowo łatwa. Jednak w przypadku linii komórkowych, które rosną w grudkach, może być konieczne doprowadzenie komórek do zawiesiny pojedynczych komórek przez odwirowanie i ponowne zawieszenie przez pipetowanie w mniejszej objętości przed zliczeniem.

Materiały

• Podłoże do hodowli komórkowych: wstępnie ogrzane do odpowiedniej temperatury (patrz arkusz danych linii komórkowej ECACC dla właściwej pożywki i temperatury)
• 70% (v/v) alkohol w sterylnej wodzie (793213)
• Roztwór błękitu trypanu (T8154)

Sprzęt

• Środki ochrony osobistej (sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny, przyłbica ochronna)
• Łaźnia wodna ustawiona na odpowiednią temperaturę
• Szafka bezpieczeństwa mikrobiologicznego na odpowiednim poziomie hermetyczności
• Inkubator
• Preetykietowane kolby
• Odwrócony mikroskop z kontrastem fazowym
• Wirówka
• Hemocytometr lub automatyczny licznik komórek, taki jak Licznik komórek Scepter™.
• Marker Pen
• Pipety
• Stojak na ampułki
• Tkanka

Procedura

1. Zobacz hodowle przy użyciu odwróconego mikroskopu z kontrastem fazowym. Komórki rosnące w fazie wzrostu wykładniczego powinny być jasne, okrągłe i załamujące światło. Hybrydomy mogą być bardzo lepkie i wymagać delikatnego uderzenia w kolbę w celu odłączenia komórek. Komórki transformowane EBV mogą rosnąć w bardzo dużych skupiskach, które są bardzo trudne do policzenia, a środek dużych skupisk może być nieżywotny.
2. Pobierz małą próbkę (100-200 μl) komórek z zawiesiny komórkowej i policz komórki. Oblicz komórki/ml i ponownie posiej żądaną liczbę komórek do świeżo przygotowanych kolb, bez wirowania, po prostu rozcieńczając komórki. Zalecana gęstość wysiewu znajduje się w arkuszu danych dostarczonym z linią komórkową.
3. Powtarzaj tę czynność co 2-3 dni.

Kluczowe punkty

1. Jeśli linia komórkowa jest hybrydomą lub inną linią komórkową, która wytwarza substancję (np. rekombinowane białko lub czynnik wzrostu) będącą przedmiotem zainteresowania, zachowaj zużytą pożywkę do analizy.
2. Jeśli komórki wymagają zagęszczenia, należy odwirować je z prędkością 150 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości, a następnie przenieść do naczynia hodowlanego.

Rysunek 1. Przykłady linii komórek w zawiesinie. Komórki Jurkat E6.1 24 godziny (A) i 72 godziny (B) po zamrożeniu/rozmrożeniu wykazują typową morfologię limfoblastów w zawiesinie. Konfluencja powinna być dokładnie monitorowana i pasażowana, gdy komórki osiągną ~80% konfluencji.