Glukoza w hodowli komórkowej

Znaczenie i zastosowanie glukozy w hodowlach eukariotycznych bez surowicy, w tym hybrydoma i komórki jajnika chomika chińskiego (CHO)

Glukoza, dodatek do pożywek bez surowicy, przydatny w produkcji biomateriałów, inżynierii tkankowej i pożywkach specjalistycznych:

Glukoza jest rozpuszczalnym cukrem heksozowym dodawanym do wszystkich pożywek do hodowli komórkowych, w tym pożywki Amesa; Basal Medium Eagle (BME); BGJb Medium Fitton-Jackson Modification; Click's Medium; CMRL-1066 Medium; Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50); F-12 Coon's Modification; Fischer's Medium; H-Y Medium (Hybri-Max^®); Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM); McCoy's 5A Modified Medium; MCDB Media; Medium 199; Minimum Essential Medium Eagle (EMEM); NCTC Medium; Nutrient Mixture, Ham's F-10; Nutrient Mixture, Ham's F-12; Nutrient Mixture Ham's F-12 Kaighn's Modification (F12K); RPMI-1640; Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium; Waymouth Medium MB; Williams Medium E i różne zastrzeżone media. Pożywka L-15 zawiera galaktozę zamiast glukozy.

Ilość glukozy w preparatach do hodowli komórkowych waha się od 1 g/L (5,5 mM) do nawet 10 g/L (55 mM). Wiele klasycznych pożywek jest uzupełnianych około 5,5 mM D-glukozy, co w przybliżeniu odpowiada normalnemu poziomowi cukru we krwi in vivo. Pożywki te obejmują: Medium Amesa; Basal Medium Eagle (BME); Click's Medium; CMRL-1066 Medium; Fischer's Medium; Medium 199; Minimum Essential Medium Eagle (EMEM); NCTC Medium; oraz Swim's S-77 Medium. Seria pożywek MCDB zawiera glukozę w zakresie od 3,9 do 10 mM. F-12 Coon's Modification zawiera 10 mM, a RPMI-1640 i Williams Medium E zawierają 11 mM glukozy.

Stężenia glukozy zbliżające się do 10 mM są poziomami przedcukrzycowymi. Stężenia glukozy powyżej 10 mM są analogiczne do stanu cukrzycowego w systemie hodowli komórkowej. Jest to ważne, ponieważ te same procesy, które mogą wpływać na komórki i cząsteczki in vivo mogą wystąpić in vitro. Konsekwencją hodowli komórek w warunkach, które są zasadniczo cukrzycowe, jest to, że komórki i produkty komórkowe są modyfikowane przez procesy glikacji i glioksydacji. Procesy te powodują wtórne modyfikacje potranslacyjne białek terapeutycznych wytwarzanych w hodowlach komórkowych.

Kilka ważnych pożywek stosowanych jako pożywki bazowe do projektowania zastrzeżonych pożywek stosowanych w bio-produkcji i inżynierii tkankowej zawiera cukrzycowe poziomy suplementacji glukozy. DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50) zawiera 17,5 mM D-glukozy; DMEM (Hi), GMEM i IMDM zawierają 25 mM D-glukozy; a H-Y Medium (Hybri-Max^®) i Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium zawierają odpowiednio 22,6 i 28,9 mM D-glukozy. Takie poziomy glukozy wymagają specjalnych strategii formulacji w celu ochrony komórek i produktów komórkowych przed stresem oksydacyjnym i karbonylowym wywołanym glukozą. Więcej informacji na temat D-glukozy jako dodatku do hodowli komórkowych można znaleźć w naszym Media Expert^®.

Podstawowe funkcje glukozy w systemach hodowli komórkowych:

Komórki zwierzęce, heterotrofy, czerpią energię ze sprzężonych reakcji utleniania-redukcji. Glukoza jest podstawowym paliwem dla heterotrofów. Energia pochodząca z glukozy jest przechowywana w postaci wysokoenergetycznych wiązań fosforanowych w ATP lub innych trifosforanach nukleotydów oraz jako bogate w energię atomy wodoru związane z koenzymami NADP i NAD. Szlaki metaboliczne zaangażowane w produkcję i wykorzystanie tych wysokoenergetycznych produktów pośrednich to

• cytoplazmatyczny szlak glikolityczny
• cytoplazmatyczny bocznik pentozofosforanowy, PPP
• cytoplazmatyczny:mitochondrialny transfer asparaginian:jabłczan
• cytoplazmatyczny:mitochondrialny transfer glicerol:fosforan
• mitochondrialny cykl kwasu trikarboksylowego, TCA
• mitochondrialny łańcuch transportu elektronów

Efektywny metabolizm energetyczny i utrzymanie zredukowanego środowiska komórkowego zależą od precyzyjnej równowagi tych szlaków w odpowiedzi na czynniki środowiskowe. Ważne jest, aby zrozumieć, jak i kiedy te szlaki działają w przedziałach komórki, gdy reaguje ona na zmieniające się warunki środowiskowe.

Wejście do komórki:

Glukoza nie jest w stanie dyfundować przez błonę komórkową bez pomocy białek transportujących. Zidentyfikowano co najmniej 13 białek transportujących heksozę o różnych funkcjach. Niektóre transportery heksozy umożliwiają bierny przepływ glukozy z wysokiego do niskiego stężenia bez konieczności wydatkowania energii komórkowej. Te, które przemieszczają glukozę wbrew jej gradientowi stężeń, zużywają energię, zazwyczaj w postaci ATP. In vitro,  zewnętrzne stężenie glukozy przekracza stężenie wewnątrzkomórkowe. W takich warunkach ważne są pasywne transportery heksozy. Transportery Glut-2, Glut-3 i Glut-5 występują głównie w wyspecjalizowanych tkankach. Glut-1 i Glut-4 występują w wielu typach komórek. Wiele typów komórek ma więcej niż jeden typ transportera heksozy.

Obrona komórkowa:

Po wejściu do komórki glukoza jest fosforylowana do glukozo-6-fosforanu (G6P) głównie przez heksokinazę. G6P może zostać przekształcony w glukozo-1-fosforan (G1P) lub wejść na szlak glikolityczny lub pentozofosforanowy. Ilości G6P, które są metabolizowane przez szlak glikolityczny i pentozofosforanowy (PPP) są kontrolowane przez względną aktywność fosfofruktokinazy (PFK) i dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD). Równowaga aktywności PFK i G6PD jest regulowana na wielu poziomach.

Glukoza zapewnia siłę redukującą potrzebną do neutralizacji gatunków oksydacyjnych (stres oksydacyjny), które tworzą się in vivo i in vitro. Cytoplazmatyczny NADP indukuje G6PD do przekształcenia G6P w 6-fosfo-gamma-lakton i inicjuje PPP. Jednocześnie G6PD redukuje NADP do NADPH. NADPH jest głównym reduktorem dla glutationu i tioredoksyny, dwóch bardzo ważnych cząsteczek do zarządzania stresem oksydacyjnym. Jeśli komórka nie jest w stanie utrzymać zredukowanego środowiska wewnątrzkomórkowego, wejdzie w apoptozę. Metabolizm glukozy poprzez oksydacyjną gałąź szlaku pentozofosforanowego zapewnia siłę redukującą potrzebną do utrzymania puli NADPH. Należy zauważyć, że G6PD metabolizuje G6P przed wytworzeniem jakichkolwiek metabolitów glukozy, które mogą zaangażować się w metabolizm energetyczny. Komórki in vitro są poddawane stresowi oksydacyjnemu, a ich zdolność do przetrwania i wzrostu może być znacząco zależna od ich zdolności do generowania NADPH poprzez PPP.

Energia komórkowa:

Gdy poziom glukozy jest wystarczający, jej metabolity przechodzą przez PPP i szlaki glikolityczne, tworząc gliceraldehyd-3-fosforan (G3P). Energia z glikolizy, która jest ostatecznie przechowywana jako ATP, pochodzi z reakcji zachodzących na poziomie gliceraldehydu-3-fosforanu i poniżej. Pirogronian i witamina NAD odgrywają różne role w przenoszeniu równoważników redukujących do układów mitochondrialnych. NAD dostarcza równoważniki redukujące do systemu transportu elektronów przez wahadłowce, które omijają cykl TCA, a pirogronian dostarcza równoważniki redukujące przez cykl TCA.

NAD:NADH:

Glikoliza G3P do pirogronianu jest inicjowana przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanu (G3PD). Ten wieloetapowy proces generuje cytoplazmatyczny ATP i NADH. Reakcja G3PD zależy od dostępności utlenionego cytoplazmatycznego NAD. NAD nie przemieszcza się między mitochondriami a cytoplazmą, a ilość cytoplazmatycznego NAD jest ograniczona. W warunkach wysokiego stężenia glukozy, gliceraldehyd-3-fosforan będzie gromadził się w komórce, chyba że cytoplazmatyczny NADH będzie stale ponownie utleniany. Komórki utleniają cytoplazmatyczny NADH za pomocą kombinacji trzech szlaków, czółenka asparaginian:jabłczan, czółenka glicerol:fosforan oraz podczas konwersji pirogronianu do mleczanu.

Szlak asparaginian:jabłczan:

Szlak asparaginian:jabłczan transportuje równoważniki redukujące z cytoplazmatycznego NADH, wytwarzane podczas utleniania G3P, do macierzy mitochondriów w postaci jabłczanu. Robiąc to, regeneruje NAD, który może być wykorzystany przez G3PD do utrzymania glikolizy. System ten jest częściowo napędzany przez glutaminę.

Przerzut glicerolowo-fosforanowy:

Komórki mogą regenerować cytoplazmatyczny NAD poprzez czółenko glicerolowo-fosforanowe. Transfer ten zależy od aktywności cytoplazmatycznych (1.1.1.8) i mitochondrialnych dehydrogenaz fosforanu glicerolu (EC 1.1.99.5). Enzymy te przekształcają fosforan dihydroksyacetonu i fosforan-3-glicerolu wewnątrz i na zewnątrz mitochondriów i skutecznie przenoszą równoważniki redukujące z cytoplazmatycznego NADH do kompleksu dehydrogenazy zlokalizowanego między wewnętrzną i zewnętrzną błoną mitochondrialną. Wiele transformowanych komórek nie posiada cytoplazmatycznej dehydrogenazy fosforanu glicerolu. System ten nie jest napędzany przez aminokwasy.

Komórkowa dehydrogenaza kwasu mlekowego

Komórkowa dehydrogenaza kwasu mlekowego (LDH) może ponownie utleniać cytoplazmatyczny NADH poprzez konwersję pirogronianu do kwasu mlekowego. Jest to marnotrawny proces, który prowadzi do metabolicznej ślepej uliczki. NADH, który nie został utleniony przez transfer asparaginian:jabłczan lub glicerol:fosforan, jest metabolizowany przez LDH. Nagromadzenie kwasu mlekowego w systemach hodowli komórkowych jest dowodem na to, że wahadłowce nie są w stanie ponownie utlenić całego NAD wymaganego do wsparcia katabolizmu G3P. Przy wysokich poziomach kwas mlekowy staje się toksyczny dla komórek.

Pirogronian:

Glukoza jest potencjalnym źródłem energii dla komórek, gdy jej metabolit, pirogronian, wchodzi do mitochondriów i jest dekarboksylowany do acetylo-CoA. Mitochondrialny acetylo-CoA jest przekształcany w cytrynian, który albo zasila cykl kwasów trikarboksylowych (TCA), albo opuszcza mitochondria do cytoplazmy. Jeśli cytrynian wejdzie do cyklu TCA, może być dalej metabolizowany w celu wytworzenia ATP i mitochodrialnego NADH. Mitochondrialny NADH jest cząsteczką dostarczającą równoważniki redukujące do łańcucha oddechowego. Większość, ale nie całość, ATP powstaje w mitochondriach komórki podczas procesu fosforylacji oksydacyjnej. Cytrynian może opuścić mitochondria poprzez system transportu kwasów trikarboksylowych i przekazać swoje grupy acetylowe do syntezy kwasów tłuszczowych lub izoprenoidów. Pirogronian nie może dostać się do mitochondriów. Może on zostać zredukowany do kwasu mlekowego przez dehydrogenazę kwasu mlekowego. Reakcja ta jest spowodowana potrzebą utlenienia NADH do NAD w celu wykorzystania go jako substratu do utrzymania glikolizy. Pirogronian reaguje z nadtlenkiem wodoru, tworząc wodę, dwutlenek węgla i kwas octowy. Ta nieenzymatyczna reakcja pomaga komórce bronić się przed utleniającymi produktami pośrednimi.

Chemiczne atrybuty D-glukozy, które czynią ją użytecznym suplementem pożywki bez surowicy:

D-glukoza:

Wzór cząsteczkowy: C₆H₁₂O₆

Masa cząsteczkowa: 180,16

Glukoza to sześciowęglowy cukier aldehydowy, który występuje w różnych formach stereoizomerycznych oraz jako cząsteczka liniowa lub cyklizowana. D-glukoza jest naturalną formą wykorzystywaną przez komórki zwierzęce. D odnosi się do asymetrii wokół atomu węgla C5. Gdy glukoza jest rozpuszczona w wodzie, występuje prawie wyłącznie w postaci cyklicznej. Oznaczenia α i β odnoszą się do asymetrii wokół atomu węgla C1, gdy glukoza jest w formie cyklicznej. Formy α- i β- mogą się wzajemnie przekształcać. Proces ten nazywany jest mutarotacją.

Glukoza jest bardzo dobrze rozpuszczalna i stabilna chemicznie w normalnych roztworach fizjologicznych i mediach. Jednak glukoza jest cukrem redukującym, który uczestniczy w tworzeniu zasad Schiffa i przegrupowaniach Amadori, które powodują glikację białek i stres karbonylowy w hodowli komórkowej. Zdolność glukozy do promowania glikacji i stresu karbonylowego jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do wtórnych modyfikacji cząsteczek wytwarzanych biologicznie, zwłaszcza białek.

Produkty glukozowe zwiększające wzrost komórek Hybridoma, komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) i innych komórek eukariotycznych ssaków w hodowlach bez surowicy.

Nasz Ekspert ds. pożywek do hodowli komórkowych^® zawiera szczegółowe omówienie tego i innych suplementów pożywek bez surowicy i białek. Media Expert^® zawiera dodatkowe sekcje dotyczące surowców, zaleceń dotyczących stosowania składników, strategii formułowania i referencji. W przypadku pytań lub problemów związanych z systemem hodowli komórek eukariotycznych ssaków należy odwiedzić stronę Media Expert^® w celu uzyskania pomocnych wskazówek.