Test enzymatyczny inhibitora trypsyny
1. Cel
Standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania inhibitora trypsyny.
2. Zakres
Niniejsza procedura ma zastosowanie do wszystkich naszych produktów posiadających specyfikację inhibicji trypsyny.
3. Definicje
3.1. Woda oczyszczona - woda z systemu dejonizacyjnego, rezystywność ~18MΩcm @25 °C
3.2 Definicja jednostki - Jedna jednostka trypsyny BAEE wytworzy ΔA253nm 0.001 na minutę z BAEE jako substratem przy pH 7,6 w temperaturze 25 °C w objętości reakcji 3,2 ml.
4. Dyskusja
Inhibitor trypsyny hamuje następującą reakcję:
Ester etylowy N-benzoilo-L-argininy + H2O Trypsyna 4.nbsp; >N-Benzoilo-L-Arginina + Etanol
5. Obowiązki
Personel służb analitycznych powinien postępować zgodnie z niniejszym protokołem.
6. Bezpieczeństwo
Odnoś się do Karty Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (SDS) w celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności.
7. Procedura
7.1 WARUNKI:
T = 25 °C, pH = 7.6, A253nM, Droga światła = 1 cm
7.2 METODA:
Spektrofotometryczne oznaczanie szybkości
7.3 ODCZYNNIKI:
7.3.1 Bufor 67 mM fosforanu sodu, pH 7,6 w 25 °C (BUFOR)
Przygotować roztwór o stężeniu 8,0 mg/ml w wodzie oczyszczonej przy użyciu fosforanu sodu, jednozasadowego, bezwodnego (nr produktu S0751). Dostosować do pH 7,6 w 25 ° C za pomocą 1 M NaOH.
7.3.2 0,25 mM roztwór estru etylowego N-benzoilo-L-argininy (BAEE)
Przygotować 86 µg/ml w odczynniku 7.3.1 przy użyciu estru etylowego N-benzoilo-L-argininy, chlorowodorku (nr produktu B4500).
7.3.3 1 mM roztwór kwasu chlorowodorowego (HCl)
Przygotować 0,1% (v/v) w wodzie oczyszczonej przy użyciu 1 N kwasu chlorowodorowego.
7.3.4 Roztwór enzymu trypsyny (TRYP)
Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 1 mg białka/ml trypsyny (produkt nr T8003) w zimnym odczynniku 7.3.3.
7.3.5 Roztwór inhibitora trypsyny (INHB)
Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 1 mg/ml inhibitora trypsyny w zimnym odczynniku 7.3.1.
7.3.5.1 W przypadku oznaczania inhibitora trypsyny, ovoinhibitor (nr produktu T1886), rozcieńczalnikiem jest 200 mM fosforan sodu, jednozasadowy, pH 7,6 w temperaturze 25ºC.
7.3.5.2 W przypadku oznaczania inhibitora trypsyny typu II-S (nr produktu T9128) należy przygotować roztwór zawierający 0,60 mg/ml inhibitora trypsyny w zimnym pH 7.3.1.
7.3.5.3 Podczas oznaczania inhibitora trypsyny, zdefiniowanego Product No. T7659 (odpowiednik Irvine, CR1333), użyj czystego roztworu.
7.4 METODA BADAWCZA
Reakcja inhibicji
7.4.1 Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich pojemników:
| Uninhibited | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Odczynnik 7.3.3 (HCl) | 9.50 | 9.40 | 9.35 | 9.30 | 9.25 | 9.20 |
| Odczynnik 7.3.5 (INHIB) | ----- | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 0.30 |
| Odczynnik 7.3.4 (TRYP) | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
7.4.2 Wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze 25 ° C przez co najmniej pięć minut i nie dłużej niż sześć minut.
7.4.3 Inhibitor trypsyny (odczynnik 7.3.5) można dostosować w razie potrzeby, aby uzyskać akceptowalną liniowość.
Reakcja enzymatyczna:
7.4.4 Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich kuwet:
7.4.3. Odczynnik 7.3.
| Uninhibited | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | Puste | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Odczynnik 7.3.2 (BAEE) | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 |
| Odczynnik 7.3.3 (HCl) | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.20 |
7.4.5 Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 25°C. Monitorować stężenie A253nM aż do uzyskania stałej wartości, używając odpowiednio termostatowanego spektrofotometru. Następnie dodać:
| Uninhibited | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | Blank | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 7.4.1 (Bez ograniczeń) | 0.10 | ----- | ----- | ----- | ----- | ----- | ----- |
| 7.4.1 (Test 1) | ----- | 0.10 | ----- | ----- | ----- | ----- | ----- |
| 7.4.1 (Test 2) | ----- | ----- | 0.10 | ----- | ----- | ----- | ----- |
| 7.4.1 (Test 3) | ----- | ----- | ----- | 0.10 | ----- | ----- | ----- |
| 7.4.1 (Test 4) | ----- | ----- | ----- | ----- | 0.10 | ----- | ----- |
| 7.4.1 (Test 5) | ----- | ----- | ----- | ----- | ----- | 0.10 | ----- |
7.4.6 Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A253nM przez około 5 minut. Uzyskać ΔA253nM/minutę przy użyciu maksymalnej szybkości liniowej dla niehamowanego roztworu przy użyciu co najmniej czterech punktów danych w przedziale czasowym jednej minuty.
7.4.6.1 Niehamowana aktywność trypsyny powinna mieścić się w zakresie 85% wartości uwalniania dla aktywności.
7.4.6.2 Maksymalna szybkość liniowa (skorygowana absorbancja 253 nm/minutę) dla niezahamowanego roztworu powinna wynosić od 0,0545 do 0,0835.
7.4.7 Zastosuj przedział czasu dla niezahamowanego roztworu określony w 7.4.6 do każdego z testów i ślepej próby. Użyj tych wskaźników do obliczenia inhibicji. Testy powinny wykazać inhibicję od 20% do 80%.
7.5 OBLICZENIA
| 7.5.1 | BAEE Units/mL enzymu = | (ΔA253nM/min (Test) - ΔA253nM/min (Blank))(10.0)(df) |
| (0.001)(0.10)(0.50) |
| 7.5.2 | Units/mg solid = | BAEE Units/mL enzyme |
| mg stałego/mL enzymu |
7.5.3 Gdzie:
df = współczynnik rozcieńczenia
0,001 = zmiana A253nM/minutę na jednostkę trypsyny przy pH 7,6 w temperaturze 25°C w mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,2 ml
0.10 = Objętość (w mililitrach) mieszaniny reakcji enzymatycznej użytej w kroku 7.4.5
10,0 = Całkowita objętość (w mililitrach) reakcji inhibicji w kroku 7.4.1
0,50 = Objętość (w mililitrach) trypsyny użytej w kroku 7.4.1
| 7.5.4 | mg inhibitora trypsyny/RM= | (stężenie inhibitora trypsyny w mg/ml)(v) |
| 10.0 |
7.5.5 Gdzie:
RM = mieszanina reakcyjna
conc = stężenie
v = objętość (w mililitrach) roztworu inhibitora trypsyny użytego w kroku 7.4.1
10.0 = Całkowita objętość (w mililitrach) reakcji inhibicji w kroku 7.4.1
7.5.6 Wykreślić aktywność trypsyny (w jednostkach BAEE/mg trypsyny) w zależności od mg inhibitora trypsyny/RM. Zapisz punkt Y, nachylenie i regresję liniową (R-kwadrat). Wartość R-kwadrat powinna wynosić > lub = do 0,95.
| 7.5.7 | mg inhibitora trypsyny/ml inhibitora RM przy 100% inhibicji= | y-intercept |
| slope |
| 7.5.8 | mg inhibitora trypsyny/mg inhibitora= | mg trypsyny /mL inhibitora RM. |
| mg inhibitora trypsyny/mL inhibitora RM przy 100% inhibicji |
7.6. KOŃCOWE STĘŻENIE ANALIZY:
W reakcji o objętości 3,20 ml końcowe stężenia są następujące: 63 mM fosforan sodu, 0,23 mM BAEE, 0,002 mM HCl, 0,005 mg trypsyny i 0,001 mg inhibitora trypsyny.
Network error: Failed to fetch
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim.
