ELISpot Assay: Funkcionális sejtes immunológia

Mi az ELISpot Assay? Az immunválasz és az ELISpot - a szükségszerűség az innováció anyja Az ELISpot platform páratlan teljesítménye a T-sejtek funkcionális elemzéséhez ELISpot optimalizálás Eredeti gondolatok Eredeti gondolatok A pre-wetting kérdése	Bevonatolás a befogadó antitesttel Blokkolási lépés Cells - Plating és stimulálás Detection - Chromogenic vs. Fluoreszcens lehetőségek Foltszámlálás és elemzés - Mi a valódi folt? Hibaelhárítási útmutató a kétértelmű Elispot-eredmény értelmezéséhez és korrigálásához

Mi az ELISpot Assay?

Az enzimhez kötött immunszorbent spot (ELISpot) assay optimális körülmények között lehetővé teszi több szekréciós termék vizualizálását egyetlen reagáló sejtből. Így az ELISpot minőségi (az immunfehérje típusa) és mennyiségi (a reagáló sejtek száma) információt is szolgáltat. Az assay felülmúlhatatlan érzékenységének köszönhetően a ritka sejtpopulációk (pl. antigénspecifikus válaszok) korábban nem lehetséges gyakorisági elemzése ma már viszonylag könnyen elvégezhető. A multiwell mikrolemezek tervezésének legújabb fejlesztései, beleértve a csökkentett háttérfluoreszcenciájú membránok használatát, elősegítették az Elispot-próbák széles körű alkalmazását. Ha figyelembe vesszük a tesztek érzékenységét, könnyű használhatóságát és költségeit, akkor az Elispot platform valószínűleg a legjobb választás a kutatási, terápiás és diagnosztikai közösségek számára a multifunkcionális T-sejtes tesztek fejlesztéséhez.

Az immunválasz és az Elispot - a szükségszerűség az innováció anyja

A hatékony, ugyanakkor specifikus immunválasz kialakításához elengedhetetlen az effektorok működésének pontos szabályozása. A T-limfociták adják a keretet ehhez a folyamathoz, kiválóan hangszerelve a szervezet fertőzések és rák elleni védekezését. Ezt az antigénspecifikus effektorsejtek rendkívül szelektív bevonásával és aktiválásával érik el. Az ingerek erősségétől és természetétől függően az effektor funkciók széles skálája váltható ki, beleértve a citolitikus aktivitást, többféle citokin és más bioaktív molekula kiválasztását, a proliferációt és a fertőzés helyére való szelektív hazatérést. Mivel ezek a T-limfociták és válaszaik a klinikai kimenetel valódi korrelátumait jelentik, az immundiagnosztika végső célja a válaszadók e kis hányadának megbízható azonosítása, hatásmódjuk(ok) minősítése és a válasz mértékének pontos számszerűsítése. Bár egyetlen teszt sem képes az összes releváns paraméter egyidejű mérésére, az ELISpot az effektor funkció(k) többdimenziós, kvantitatív értékelését kínálja egyetlen sejt szintjén, kiváló érzékenységgel és felbontással.

Az 1983-ban kifejlesztett,^1,2 ELISpot assay a lemez alapú enzimhez kötött immunszorbiens próbák (ELISA) és a membrán alapú Western blotting technológiák konvergenciáját jelenti, lehetővé téve a szekretált analitok kimutatását egyetlen sejt szintjén. A membránok a standard polisztirol felületekhez képest jelentősen jobb kötődési tulajdonságokkal rendelkeznek. Bár számos lehetőség létezik, az Elispotok többségét jelenleg polivinilidén-fluorid (PVDF) membránlemezeken végzik. A befogott antitest (Ab) kötődését az aminosavak, például fenilalanin vagy leucin és a PVDF közötti hidrofób kölcsönhatások határozzák meg; ez a társulás sokkal erősebb, mint a nitrocellulózfelületen kialakuló elektrosztatikus kölcsönhatások.^3,4 Az erősebb kötési kölcsönhatások nagyobb Ab-sűrűséget eredményeznek a membrán felületén, ami jobban meghatározott foltokat eredményez.⁴ Mivel az ELISpot leolvasása "foltok/forrás", a PVDF-membrán fehér színe ideális hátteret biztosít a foltok kimutatásához és elemzéséhez. A mikrolemez formátum nagyobb áteresztőképességet biztosít, és automatizálható; több minta, több inger vagy több különböző citokin egyidejűleg vizsgálható a szomszédos kutakban.

Az eredetileg az antigénspecifikus antitesteket szekretáló B-sejtek számbavételére^1,2 tervezett ELISpot -t számos feladatra adaptálták, amelyek közül a legkiemelkedőbb az antigénspecifikus citokinválaszok számszerűsítése (1. ábra). A standard vizsgálatban a citokin-specifikus Abs-eket membránfenekű 96 lyukú lemezeken immobilizálják. Ezután a sejteket (általában teljes perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC-k) vagy tisztított alcsoportokat) stimuláló szerek jelenlétében vagy hiányában vetik be. Idővel az aktivált sejtek citokineket kezdenek szekretálni, amelyek az expresszáló sejt közvetlen közelében kötődnek a befogadó Ab-hez. Ezután a sejteket kimossuk, és a foltok kimutatása szubsztrátlerakódás útján történik, egylépéses (enzimkonjugált, citokin-specifikus Ab) vagy kétlépéses (biotinilált Ab/streptavidin-enzim) antitest-kötési folyamatot követően. A jelek kialakulása után a foltok száma kézzel vagy a képalapú foltolvasók és a hozzájuk tartozó elemző szoftverek segítségével számolható össze. A válaszadó sejtek gyakoriságát és teljes számát a stimulált és a kezeletlen/kontroll kutak közötti foltok számának összehasonlításával határozzuk meg.

Ez az áttekintés kiemeli az egyedi teljesítményjellemzőket, a munkafolyamat jellemzőit és a költségelőnyöket, amelyek együttesen egyértelműen az ELISpot assay-t mint kiváló platformot azonosítják az immunválaszok hátterében álló komplexitások feltárására. Emellett felvázoljuk az e technológiával kapcsolatos legújabb fejlesztéseket, és azt, hogy ezek a fejlesztések hogyan biztosítanak nagyobb hasznot a kutatóközösség számára, akár mechanisztikus vizsgálatokra, akár diagnosztikára, akár terápiás tervezésre összpontosítanak. Végül részletesen tárgyaljuk a vizsgálati protokollt, hangsúlyt fektetve a bevált gyakorlatokra és a hibaelhárítási útmutatókra.

Az Elispot platform páratlan teljesítménye a T-sejtek funkcionális elemzéséhez

Az adott immunválasz összetettségét hangsúlyozza a paraméterek sokasága, amelyeket értékelni kell ahhoz, hogy tisztán lássuk a folyamat hátterében álló fiziológiai mechanizmusokat. Bár számos vizsgálati forma létezik, az ex vivo T-sejtek effektor funkciójának vizsgálatában leggyakrabban használtak közé tartozik az áramlási citometria, az ELISpot, az ELISA, a multiplex bead array-k és a kvantitatív PCR. Bár mindegyiknek megvannak a sajátos erősségei és korlátai, az Elispot-próbák egyértelmű előnyökkel rendelkeznek, amelyeket a következő részben kiemelünk.

Az ELISpot , akárcsak az áramlási citometrián alapuló intracelluláris citokinfestés (ICS), közvetlenül meghatározza az antigén (Ag)-specifikus T-sejtek gyakoriságát, ami az immundiagnosztika egyik alapvető kompetenciája. Ilyen felbontóképesség nem érhető el a felülúszó-alapú vizsgálatokkal, mint például az ELISA vagy a multiplex gyöngysorok, ahol a mérések az adott mintakútban lévő összes sejt által termelt citokin tömeges termelésén alapulnak. Akut HIV-fertőzötteknél az IFNγ-t termelő sejtek gyakorisága a gyakori visszahívási antigénekre (pl. TT vagy PPD) adott válaszként hasonló volt az egészséges donorokéhoz; a foltok mérete azonban drámaian lecsökkent⁵. Ez az eredmény arra utal, hogy a HIV-specifikus T-sejtek funkciója, és nem a sejtek száma károsodott. Hasonlóképpen, az in vivo frissen aktivált T-sejtek a "e;régebbi"e; memória T-sejtekhez képest fokozott sejtenkénti citokintermelést mutathatnak^6,7. A hosszú távú memória és a nemrégiben aktivált alcsoportok megkülönböztetésének képessége hatással van az autoimmun betegségek és a krónikus fertőzések T-sejt-diagnosztikájára. A tömeges vizsgálatok eredményeit a veleszületett immunrendszerből származó háttérjel(ek) hozzájárulása is megzavarja. Az Ag-specifikus válasz hígulása a jel általános ellaposodását eredményezi; ez a probléma leginkább a ritka populációk, például a PBMC-ben keringő tumorsejtek (CTC) vagy a csontvelőben disszeminált tumorsejtek - mindkettő a metasztázis korai markere - jelenlétének kimutatásában fontos⁸.

1. ábra. Az ELISpot Assay munkafolyamat. (1) Vond be a membránt a befogási ellenanyaggal. Adjon hozzá immunsejteket és stimulálja. (2) A reagáló sejtek citokineket termelnek. A kívánt citokin kötődik a sejt alatti capture Ab-hoz. (3) Mosás a sejtek eltávolításához. Adjunk hozzá egy második citokin-specifikus biotinilált Ab-t, amely kötődik a citokin-Ab komplexhez. (4) Adjunk hozzá sztreptavidin-enzim konjugátumot. (5) Adjunk hozzá enzimszubsztrátot és fejlesszük ki. Egy kúton belül minden egyes reagáló sejt egy folt kialakulását eredményezi.

Hogy a T-sejt repertoár képes legyen potenciálisan végtelen számú fertőző ágens felismerésére, miközben egyidejűleg megkülönbözteti őket önmaguktól, a teljes naiv pool ≥ 10¹² egyedi T-sejt receptor (TCR) specifitást tartalmaz. Következésképpen fertőzés hiányában a keringő memóriasejtek bármely antigénre specifikus frekvenciája meglehetősen alacsony, jellemzően 1:10.000-1.000.000^9.10 között mozog. Az ilyen ritka események kimutatása jelentős kihívást jelenthet az áramlás alapú platformok számára, ahol az érzékenység alsó határa a jelentések szerint 0,02%¹¹. Az ELISpotokhoz képest a tenyésztési felülúszókban végzett citokinmérések érzékenységi küszöbértékét tovább csökkenti az analit hígulása a környező miliőben, a járulékos sejtek általi felszívódás és az enzimatikus lebomlás. Ezzel szemben, az ELISpot-próbák kevesebb mint 25 IFNγ-termelő T-sejtet mutatnak ki millió PBMC-re vetítve (0,0025%)^12,13; ez a kimutatási érzékenység közel 10-szeres növekedésének felel meg. Az ELISpot assay nagy érzékenysége az allergia kutatásában is fontos, ahol a nagyon alacsony frekvenciájú Th2 citokin-termelő sejtek azonosítása kritikus mind a betegség nyomon követése, mind az immunterápiák fejlesztése szempontjából¹⁴. Konkrétan, mind az áramlási citometria, mind az ELISA platformok az IL-4, a Th2-válasz domináns indikátorának¹⁵ elégtelen kimutatását mutatják.

Az ELISpot egyike azon kevés technikáknak, amelyek lehetővé teszik a biológiai funkció (pl. a citokin felszabadulás) kvantitatív, egysejtes elemzését. Az intracelluláris citokinfestéssel (ICS), ahol a citokin kimutatása a felszabadulás előtt történik, a szekréciós folyamat előtt vagy alatt bekövetkező poszttranszlációs moduláció miatt félrevezető eredmények adódhatnak 16 . Az ICS-vizsgálat időtartamát korlátozza a fehérjetranszport-gátlók, például a Brefeldin A vagy a Momensin toxicitása. A kvantitatív RT-PCR esetében a kimutatás még távolabb van a tényleges működéstől, mivel a mért célpont az mRNS. Az ELISpot -vizsgálatok a szekréciós kinetikától is függetlenek, ami jelentős tény, tekintve a reagáló T-sejtek nem szinkronizált természetét. Az ICS esetében minden sejtet elpusztítanak fixálással egy előre meghatározott időpontban. A citolitikus válasz mediátorok, mint például a granzim B és a perforin, a granulákban tárolódnak, majd a megfelelő ingerekre^17-19 felszabadulnak. Ennek az egyedülálló szabályozási mechanizmusnak köszönhetően az ICS tévesen minden effektor memória sejtet (az összes T-sejt ~20%-át) perforin-pozitívként azonosít. Talán nagyobb jelentőséggel bír a Lysispot assay, egy módosított ELISpot amely képes az Ag-specifikus citotoxikus CD8+ T-sejtek effektor funkciójának közvetlen célsejt-lízis révén történő megszámlálására²⁰. A Lysispot assay kifejlesztéséig, mivel a legtöbb citotoxicitási vizsgálatot ömlesztett kultúrákon végzik²¹, az IFNγ ELISpotokat általában a CD8+ sejtes immunitás korrelátumaként használták^22-24.Az Lysispot használata a HIV vizsgálatában kimutatta, hogy nem minden IFNγ-termelő sejt képes az ölésre²⁵. Ez a megállapítás is rávilágít arra, hogy az egysejtes immunvizsgálatokban nagyobb sokaságú kimutatásra van szükség.

A T-sejtek az effektorosztályok széles skáláján fordulnak elő, és ezek közül egy vagy több expressziója a kórokozó típusától és az alany immunstátuszától függően nagymértékben változhat. A tuberkulózis (TBC) diagnosztikája terén felhalmozódott eredmények azt sugallják, hogy a citokin szignatúra különbségei világosabb különbséget tehetnek a fertőzés tünetmentes látens és aktív formái között. Az aktív esetek gyors azonosítása a legkritikusabb, mivel ezek az egyének jelentik a legnagyobb egészségügyi kockázatot a közösségre^26-30. Bár a felülúszóban végzett gyöngyalapú kvantitatív analízis többparaméteres elemzést tesz lehetővé, olyan korlátozásokkal küzd, amelyek kizárják a TBC és más betegségek diagnosztikai platformjaként való elfogadását. Ezzel szemben az ELISpotok alkalmasak az egyidejűleg (egy kútban) vagy párhuzamosan végzett multiplex elemzésekre. A jól bevált, két színű ELISpotokat, amelyek mind enzimatikus, mind fluoreszcens megközelítést alkalmaznak, jelenleg számos kutatási környezetben használják. A fluoreszcens ELISpotok vagy FluoroSpotok jelentős előnyöket kínálnak a kolorimetrikus formátumokhoz képest, különösen a multiplexálás és az automatizált spotdetektálás területén. Továbbá, mivel a foltfejlődés nem enzimatikus, a jelintenzitás közvetlenül arányos a foltban lévő analit mennyiségével, és ezért sokkal kvantitatívabb.

A multiplexelési kapacitás két színnél nagyobb mértékű növeléséhez olyan membránfelületekre van szükség, amelyek minimális fluoreszcens háttérjelet mutatnak. A membránfelületek erősen porózus jellegük miatt nagyon érdesek.

Ezért szórják a fényt és magas fluoreszcens hátteret mutatnak. Míg a PVDF membrán (Immobilon^®-P membrán) állítólag jobb felület a nitrocellulóznál a FluoroSpots számára, az Immobilon^®-FL PVDF membránváltozatot kifejezetten Western blotting alkalmazásokban történő fluoreszcens detektálásra tervezték, és a háttér fluoreszcens jel közel 1/100-a a standard PVDF-nek. Az Immobilon^®-FL membrán két színű IFNγ/IL-2 FluoroSpotokban való használatát bemutató adatokat a 2. ábra (képek) és az 5. ábra (6. oldal, spotszámok) mutatja be. A multiplexáláson túl a FluoroSpots lehetővé teszi két egyidejűleg mért funkcionális kimenet megkülönböztetését. A multiplexálás a szükséges mintaméret csökkentését is szolgálja. A diszkrét fluorokrómok egyre szélesebb körű elérhetősége a több fluoreszcens képalkotó műszerekkel, valamint a teljesen automatizált mintavételezéssel és adatelemzéssel kombinálva biztosítja a keretet az Ag-specifikus T-sejtválaszok ELISpotok segítségével történő felülmúlhatatlan polifunkcionális elemzéséhez.

2. ábra. Reprezentatív képek a FluoroSpot-optimalizált Immobilon^®-FL PVDF membránnal felszerelt Multiscreen^® HTS lemezeken végzett kétszínű IFNγ/IL-2 FluoroSpot vizsgálatokról. A CEF-pool a citomegalovírus, az Epstein-Barr-vírus és az influenzavírus epitópjait lefedő peptidek poolját jelenti.

A membrán és a lemez anyaga mellett a lemez színe is nagyban befolyásolhatja a FluoroSpot sikerét. A 3. ábrán bemutatott adatok rávilágítanak a különböző Multiscreen^®HTS lemezformátumok közötti képminőségbeli különbségekre. Az IFNγ/IL-2 FluoroSpotokat PBMC-sejteken végeztük el a CEF peptidek jelenlétében történő tenyésztést (250K/lyuk) követően. Szigorúan vizuális szempontból a foltok tisztasága nagyjából egyenértékű volt a tiszta és a fekete formátumokon (3A. ábra). Ezzel szemben a fehér lemezek magas háttérjelet mutattak, ami megnehezítette a spotok kimutatását, különösen a zöld csatornán (IFNγ-FITC). A magas háttér még az expozíciós idő jelentős csökkentése után is fennállt (nagyjából 1/5). A magas háttér valószínűleg a megnövekedett reflexiónak volt köszönhető a fekete vagy a tiszta keretekhez képest, ahol a fényt vagy elnyeli a környező lemez anyaga, vagy áthalad rajta. A foltok számának összehasonlítása azt mutatta, hogy a fehér lemezeken a fekete vagy a tiszta formátumhoz képest jelentősen csökkent a megszámlált foltok száma (3B-C. ábra). Az eltérés ismét jelentősebb volt az IFNγ foltok esetében, ahol az összes folt közel 80%-os csökkenése volt megfigyelhető. A háttérprobléma kiküszöbölhető lenne, ha a lyukakat kilyukasztanák és külön elemeznék; ez azonban nem biztos, hogy praktikus, ha nagy kísérleteket kell végezni. Tekintettel a hasonló teljesítményre, az átlátszó lemezformátum a praktikusabb lehetőséget kínálja, mivel megkönnyíti a reagens hozzáadásának vizuális nyomon követését is. Meg kell jegyezni, hogy minden elemzést az iSpot™ rendszerrel (AID) végeztünk. A teljesítményjellemzők különbségei miatt más fluoreszcens lemezolvasók nem feltétlenül mutatják ugyanazt a lemezpreferenciát.

3. ábra. A képen a Mabtech FluoroSpot készleteinek felhasználásával három különböző Multiscreen®HTS lemezformátumban (Clear, Black és White), teljes PBMC-n végzett kétszínű IFNγ/IL-2 FluoroSpot vizsgálat reprezentatív kútfelvételei láthatók. A CEF-stimulált kutak esetében az egyes citokinekről készült képek, valamint az overlay kép látható. A nem stimulált kutak esetében csak az IFNγ egyszínű adatai láthatók. (B) A grafikon az egyes lemezformátumok összesített adatait mutatja be három tenyésztési körülményre vonatkozóan. Minden sáv három részre van szétválasztva - IFNγ, IL-2 és kettős válaszfoltok. Minden sáv 3 ismétlés átlagát jelenti. (C) A két oszlopdiagram az egyes mért citokinekre vonatkozó összehasonlító spotadatokat mutatja. Minden sáv 3 ismétlés átlagát jelenti.

Az áramlási citometriával ellentétben, ahol a műszer alapozása mintaveszteséget eredményezhet, az ELISpotban minden egyes sejtet mérnek. Az ELISpot átlagosan tizedannyi sejtre van szükség egy teszthez, ami döntő előnyt jelent olyan körülmények között, ahol a minták értékes (távoli környezetben) és/vagy korlátozóak (gyermekgyógyászati vagy immunszupprimált vizsgálati alanyok). A 96 lyukú mikrolemezek egyik régóta fennálló problémája a fel nem használt lyukak pazarlása volt az olyan kisméretű vizsgálatoknál, mint amilyenek egy-egy betegminta diagnosztikai elemzése során előfordulnak. A diagnosztikai közösség számára kifejlesztett 8 lyukú csíkokat (M8IPS4510 termékszám) kínálunk; ez a formátum különösen vonzó a korlátozott erőforrásokkal rendelkező országok számára, ahol az olyan betegségek, mint a TBC és a HIV a legpusztítóbbak (4A. ábra). ²⁸  Az átlátszó formátumban készült csíkok alkalmasak FluoroSpots, valamint a standard enzimatikus opciókhoz, és a standard 96 lyukú lemezekhez hasonlóan teljesítenek (4B., 5. ábra). A 8 lyukú csíkok jelenleg az Oxford Immunotech T-SPOT.TB tesztjének részét képezik, amely egy FDA által jóváhagyott IFNγ ELISpot teszt, amelyet kifejezetten a tuberkulózis fertőzés diagnosztizálására terveztek.

4. ábra. (A) Kifejezetten diagnosztikai ELISpothoz tervezett 8 lyukú, membránfenekű csíklemez. Ez a formátum része a T-SPOT.TB (Oxford Immunotech), egy kereskedelmi forgalomban kapható IFNγ ELISpot kitnek, amelyet kifejezetten a tuberkulózisfertőzés diagnosztikájára terveztek. (B) Reprezentatív képek (egyszeri és átfedés) a 8 lyukú csíkokban végzett kétszínű FluoroSpotról. Az IFNγ/IL-2 FluoroSpotokat kezeletlenül hagyott egészséges PBMC-ken és CEF peptidekkel történő stimulációt követően végeztük. Minden vizsgálatot FluoroSpot készletekkel (Mabtech) végeztünk.

5. ábra. A 8 lyukú csíkok hasonlóan működnek, mint a standard 96 lyukú MultiScreen® lemezek. Az oszlopdiagram az egyes formátumok összesített adatait mutatja három tenyésztési körülményre vonatkozóan. Minden sáv három részre van bontva - IFNγ, IL-2 és kettős válaszfoltok. Minden sáv 3 ismétlés átlagát jelenti. A vizsgálatonként jóval kevesebb sejttel való munka azt is jelenti, hogy több ismétlés is elvégezhető, ami növeli a statisztikai teljesítményt. Az ilyen diszkriminációs képesség nem lehetséges tömeges vizsgálatokkal. Bár az ELISpot és az áramlási citometriás vizsgálatok hasonló protokolllépésekkel rendelkeznek, az ELISpot adatgyűjtése/elemzése sokkal egyszerűbb és kevésbé időigényes, mint az áramlási citometria. Valójában egy 96 lyukú ELISpot-lemezről származó adatok egy képalapú platformmal olyan gyorsan rögzíthetők és elemezhetők, mint amilyen gyorsan egy 300 000 sejtet tartalmazó minta elemzése egy képzett áramlási citométer-kezelő számára. Bizonyos citokinek esetében az ICS jel:zaj aránya alacsony és gyakran nem bimodális eloszlású, ami önkényessé és nehézkessé teszi a kapuzási döntéseket. Míg az áramlási citometria az alpopulációelemzéshez szükséges, felhasználófüggetlen kapuzási algoritmusok hiányával küzd, és ezért szenved a szubjektivitástól és a laboratóriumok közötti eltérésektől, addig az automatizált platformok elősegítik az ELISpot-adatok elemzésének szabványosítását és a nagyobb reprodukálhatóságot a különböző helyszíneken31. A tulajdonságok e kombinációja az ELISpotot ideális választássá teszi a nagy áteresztőképességű vizsgálati alkalmazásokhoz is, amelyeket a nagyléptékű alanyi profilalkotásban lehet alkalmazni. Például az IFNγ ELISpotokat általában a vakcinák hatékonyságának korrelátumaként használják a HIV és más betegségek potenciális jelöltjeinek azonosítására32-33.

A vizsgálat miniatürizálása egyszerre csökkentheti a cellakövetelményeket és növelheti az áteresztőképességet. A 6. ábrán bemutatott adatok a Cellular Technology Limitednél (CTL) folyamatban lévő, az ELISpotok 384 lyukú formátumban történő alkalmazásának validálására irányuló vizsgálatok részét képezik.³⁴ Ebben a példában az IFNγ ELISpotokat PBMC-ken végezték CEF-7 peptiddel történő stimulációt követően. A lemezeket a CTL ImmunoSpot^® S6 Micro Analyzerrel képezték le és elemezték. A tesztelt vetési sűrűségek tartományában a vizsgálat erős lineáris kapcsolatot (R2=0,9866) mutatott a foltképző egységek (SFU) és a sejtek száma között (6B. ábra). Végül a mikrolemezek kialakításának módosításai növelték a meglévő robotikai rendszerekkel való kompatibilitást, ezáltal javítva a potenciális áteresztőképességet is. Ezek a lemezadaptációk magukban foglalják a szigorúbb méretspecifikációkat és a merev oldalfalakat. A lemezek most már teljes mértékben kompatibilisek a szabványos fluidikai platformokkal, lemezmosókkal, valamint a képalkotó és képelemző eszközökkel.³⁵

6. ábra. (A) Egy reprezentatív kép egy 384 lyukú lemezeken, négyféle PBMC-sűrűségen (n=96 szintenként) végzett IFNγ ELISpotról. Az F12-es kút nagyítva van a folt tisztaságának bemutatása érdekében. (B) Ezen a grafikonon az IFNγ foltképző egységeket (SFU) ábrázoltuk a vetési sűrűség függvényében. Minden adatpont 96 ismétlés átlagát jelenti, a hibasávok pedig a standard eltérést. A vizsgálat erős lineáris választ mutat a vizsgált sejtmennyiségek tartományában.

Elispot optimalizálás

Míg az ELISpot -vizsgálatok lehetővé teszik a nagyon ritka események gyakoriságának meghatározását, az adatok értelmezése félreérthetővé válhat, ha (1) az antigént tartalmazó kutakban a foltok száma alacsony, (2) a negatív kontrollkutakban a foltok száma magas, és különösen, ha mindkettő egyszerre fordul elő. Ezért az elsődleges feladatnak - még a statisztika alkalmazása előtt - az alapvető vizsgálati paraméterek és reagensek optimalizálásának kell lennie a jel-zaj arány maximalizálása érdekében. Míg a rendkívül specifikus, ELISpot-validált Ab-párok használata kulcsfontosságú az assay sikeréhez, számos más lépés megfelelő megfontolása és végrehajtása szükséges az optimális teljesítmény biztosításához. Ez a szakasz a standard T-sejt ELISpot assay áttekintését nyújtja, különös hangsúlyt fektetve a kulcsfontosságú lépések mögött meghúzódó kísérleti logikára és a hibás vagy nem egyértelmű eredmények hibaelhárítására vonatkozó javaslatokra.

Kezdeti gondolatok

A lemez (membrán)

PVDF membránlemezek (katalógusszámok. MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510) ajánlott a vegyes cellulóz-észter formátummal (katalógusszám: MSHAS4510) szemben, a befogadó Ab kissé jobb kötődése és a foltdetektálásban nyújtott jobb teljesítmény miatt, különösen fluoreszcens alkalmazások esetén. A PVDF-lemezek egyetlen hátránya az anyag rendkívüli hidrofóbitása,³³ ez a tulajdonság szükségessé teheti a bevonó Ab hozzáadása előtt az alkohollal való előzetes nedvesítést. Ennek a lépésnek a lehetséges buktatóit egy későbbi szakaszban ismertetjük. Mivel a kevert cellulózmembrán hidrofil, az ELISpotok előzetes nedvesítés nélkül is elvégezhetők,^36,37

Negatív/pozitív kontrollok

A releváns kontrollok elengedhetetlenek az Ag-specifikus válaszok ELISpot segítségével történő méréséhez. A negatív kontrollok rutinszerűen stimuláció nélkül tenyésztett sejtekből állnak, míg a poliklonális T-sejt-aktivátorokat általában pozitív kontrollként használják a sejtek és a vizsgálat működőképességének megerősítésére. A pozitív kontrollok közé tartoznak az anti-CD3/CD28 Abs, a fitohemagglutinin (PHA) és a konkanavalin A (ConA). Ezek az aktivátorok számos gyakori citokin, köztük az IFNγ, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13 (Th2) kiválasztását indukálják. Egy másik gyakori kontroll a kereskedelemben kapható CEF (Cytomegalovírus, Epstein-Barr-vírus, influenzavírus) peptidkészlet. Ezek mindhárom vírus több epitópjából állnak, amelyekre a legtöbb egészséges egyén (~ 90%) rendelkezik CD8-reagáló T-sejtekkel.³⁸

Tányérszervezés - peremhatások

A tányér 8 sorból álló tömb, mindegyikben 12 lyukkal. A lemez perifériáján lévő kutak (1. és 12. oszlop, A és H sorok) közvetlenebbül érintkeznek a környező környezettel, és így eltérhetnek a belső kutaktól. Különösen a perifériás kutakból történő tápfolyadékpárolgás befolyásolhatja a vizsgálat általános teljesítményét hosszabb tenyészetekben. Ahol lehetséges, a valódi mintakutak perifériáján lévő "csak médiumot tartalmazó" kutak használata minimalizálhatja ezt a hatást.

A nedvesítés előtti nedvesítés kérdése

A korábbi összehasonlító tesztek kimutatták, hogy a PVDF-alapú MultiScreen^® megfelelő etanolos előkezelése a PVDF-alapú MultiScreen^®HTS-lemezek (15 µl frissen készített 35%-os v/v etanol, amelyet azonnal vízzel történő mosás követ) a foltok számának növekedéséhez (jobb érzékenység) és élesebben meghatározott foltokhoz (a pontosabb kvantitáció érdekében) vezethet (7. ábra)³⁵. Az előnedvesítés azonban nem alkalmazható általánosan minden ELISpotra ; követelménye a befogadó Ab eredendő hidrofób jellegétől függ; ezért az előnedvesítési protokollt az alkalmazás előtt optimalizálni kell^35,36. A nagyobb mennyiségű alkohollal, hosszabb expozíciós idővel vagy koncentráltabb alkohollal történő túlkezelés a maradék folyadéknak a membrán és az aluljáró közé történő beszorulásához vezethet, ami rossz vizsgálati teljesítményt vagy - ami még kritikusabb - kútszivárgást eredményezhet. Az alkoholos előnedvesítéssel kapcsolatos szivárgás nem jelent gondot az alulcsatorna nélküli ELISpot lemezek (MAIPSWU10 katalógusszámú) használata esetén; azonban ez a formátum a hosszabb tenyésztés során potenciálisan párologtathatja a médiumot, valamint sterilitási problémákat okozhat a kitett alapmembrán körül. Egy másik alternatíva a hidrofil membránnal, például kevert cellulóz-észterrel készült mikrolemezek használata. Azt is fontos megjegyezni, hogy miután a lemezeket etanollal kezelték, a vizsgálat teljes időtartama alatt nedvesen kell tartani őket.

7. ábra. (A) PVDF membránfenekű lemezeken, etanolos előnedvesítéssel és anélkül végzett egér IFN gamma ELISpot reprezentatív kútfelvételei. (B) A MultiScreen®HTS-lemezben lévő egyes kutak felépítését bemutató vázlat. A membrán alja és az aluljáró teteje közötti távolság növelésére irányuló legújabb tervezési változtatások csökkentették a szivárgás előfordulását.

Bevonás befogadó antitesttel

A hagyományos ELISA-kban a felülethez való kötődés passzív adszorpció útján történik, és lúgos körülményeket igényel (0,2 M nátrium-karbonát/bikarbonát pH>9) a fehérje:polisztirol kölcsönhatás elektrosztatikus komponensének maximalizálása érdekében. Ezzel szemben a PVDF-membránok ELISpot bevonása kizárólag hidrofób erők által közvetített. Emiatt általában foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS) puffert (pH 7,4) használnak. A membránok emellett lényegesen nagyobb felületet (300X) kínálnak a kötődéshez, mint a polisztirol lemezek³⁹. A teljesítmény biztosítása és a költséghatékonyság maximalizálása érdekében kritikus fontosságú a lyukanként használt befogadó Ab mennyiségének standardizálása. Az optimális teljesítmény érdekében javasoljuk a bevonó és a detektáló Abs kezdeti titrálását együttesen. Általában az ELISpot bevonásnál a jó kiindulási pont 0,5-1 µg Ab/lyuk (5-10 µ/mL 100 µL-ben); ez 5-10-szer nagyobb bemenet, mint az ELISA-k esetében. Az alacsonyabb bevitel diffúzabb foltmorfológiát, valamint csökkentett foltszámot eredményezhet. Mindkét paramétert figyelembe kell venni az új vizsgálati protokollok validálásakor, különösen a kvantitatív expresszió (foltméret), illetve az alacsony gyakoriságú események meghatározásakor. A Mabtech teljes mértékben validált ELISpot Ab-párok (bevonat és detektálás) széles választékát kínálja humán minták, valamint más fajok vizsgálatához (részletekért lásd www.mabtech.com).

Blokkolási lépés

A befogadó Ab-val történő inkubációt követően a lemezeket alaposan át kell mosni, majd blokkolni és 2 órán át 37 °C-on egyensúlyban tartani ugyanazzal a táptalajjal (200 µl/lyuk), amelyet a sejtstimuláció során használunk (mínusz aktivátor). A blokkoló közegben a lezárt PVDF-lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on lehet tárolni. Hosszabb tárolás fehérje kicsapódást és csökkent foltfelbontást eredményezhet. Fontos megjegyezni, hogy amikor a lemezeket eltávolítjuk a 4 °C-os hőmérsékletről, és hagyjuk, hogy elérjék a szobahőmérsékletet, a tömítőszalagot is el kell távolítani a gázok tágulása miatti szivárgás elkerülése érdekében.

Cells - Plating and Stimulation

Fresh vs. Frozen

Az ELISpot vizsgálatok nagy részét a PBMC-k vagy a dúsított T-sejt alcsoportok teszik ki. A vérből tisztított PBMC-k a funkcionális aktivitás elvesztése nélkül kriokonzerválhatók és felolvaszthatók⁴⁰. Tekintettel a betegségből származó minták gyakran értékes jellegére, a kriokonzerválásnak több előnye is van: (1) az adatok egymástól függetlenül reprodukálhatók, (2) több analit is értékelhető, (3) a betegminták raktározhatók és egyidejűleg vizsgálhatók, így minimálisra csökkenthető a vizsgálatok közötti lehetséges eltérés. Az életképes sejtek optimális kinyerése érdekében kövesse az alábbi ajánlásokat: (A) a fagyasztás során a sejtek és a fagyasztóközeg szobahőmérsékleten legyen a keverés előtt, és (B) a kiolvasztás során a kiolvasztott sejtek mosása során az ozmotikus lízis minimalizálása érdekében a sejteket jégen lévő 15 ml-es kúpos csőbe kell helyezni, és lassan hozzáadni a hideg közeget.

A benzonáz^® nukleáz előnyei

A fagyasztott PBMC-k használatának további kihívása a sejtek összecsomósodása a felolvasztás során. A csomósodást gyakran a szabad DNS és a sejttörmelék jelenléte okozza; úgy tűnik, hogy mind a donorforrással, mind a vér kezelésével összefügg. Különösen akkor fordul elő gyakrabban csomósodás, ha a vért a PBMC-izolálás előtt egy éjszakán át tárolták. Az éjszakán át tárolt vér pontszámítási eredményei drámai csökkenést mutattak a friss vérből izolált megfelelő PBMC-kre adott válaszokhoz képest.³⁶ A legnagyobb mértékű jelcsökkenést azoknál a mintáknál észlelték, amelyekben a legnagyobb mértékű sejtcsomósodás volt megfigyelhető. A vizsgálat teljesítményének javítása érdekében javasoljuk a DNS és RNS minden formáját lebontó benzonáz^® nukleáz (71205-ös termékszám) hozzáadását a vizsgálati közeghez a felolvasztási eljárás első két mosási lépése során. A benzonáz^® nukleázzal feldolgozott éjszakai vér PBMC-kből származó eredmények jobban megközelítik a friss vérből izolált sejtekkel kapott eredményeket. Ezenkívül a benzonáz^® nukleáz hozzáadása nem eredményezett változást a sejtek életképességében vagy bizonyos felszíni markerek, köztük a CD₄, CD₈, CD₃₈ vagy CD₆₂L expressziójában.³⁶

A sejtszámlálás és a százalékos életképesség értéke

Amikor az Ab lépések standardizálása megtörtént, a számszerűsített sejthozam és az egyes minták integritásának különbségei jelentik a vizsgálati variabilitás legnagyobb forrását. Bár az összes sejtszám fontos, a tenyésztési komponens beállításakor figyelembe veendő kritikusabb tényező a sejtek életképessége. Az elhalt és apoptotikus sejtek százalékos arányának meghatározása nemcsak a tenyésztés beállítása szempontjából fontos, hanem mennyiségi információt is szolgáltat a minta általános minőségéről. Ez utóbbi komponens különösen hasznos a fagyasztás-felengedés folyamatának sikerességének/hiányosságának értékelésénél. A kézi számlálási módszerek, mint például a Trypan Blue kizárása hemacitométerrel, a felhasználó szubjektivitása miatt nem elég pontosak. Továbbá ezek a módszerek nem biztosítják az apoptotikus frakció mérését. A fluoreszcens festékeket használó áramlási citometriás automatizált sejtszámlálás, mint például a Muse™ sejtanalizátor és a ViaCount^® reagens, az életképes sejtek megszámlálásában a kézi módszerekhez képest nagyobb pontosságot mutatott.⁴¹

Cells Per Well and Replicates

A T-sejt ELISpot számlálás átlagosan 100 000-800 000 sejt^5,9-13 közötti tartományban mutat linearitást a PBMC-k esetében. Ahol lehetséges, a sejteket sorozatban kell hígítani és három példányban kell kiültetni. Sajnos a 96 lyukú lemezek lyukméretének korlátozása miatt (0,3 cm²) a lyukankénti 400 000-nél több sejt beültetése túlzsúfoltságot és sejtek egymásra rakódását eredményezheti. Ennek következménye diffúz foltok keletkezése a sejteknek az Ab-bevonatú membránnal való közvetett érintkezése miatt. Az olyan esetek legjobb nyomon követése érdekében, amikor az Ag-specifikus reagálók gyakorisága alacsony, és nagyobb sejttömegre van szükség, vagy nagyobb lyukakban végezze el a vizsgálatokat, vagy végezzen ismétlődő lyukakat maximális sejtsűrűséggel. Ismétlődő kutak használatával az összes kútból származó foltok száma összegezhető a válaszfrekvencia (SFU/összes beültetett sejt) kiszámításához.

Az inkubáció során nem javasoljuk a lemezek egymásra helyezését, mivel ez a lemezek közötti hőmérséklet-eltérésekhez és potenciális különbségekhez vezethet a foltok méretében és/vagy számában. Az is fontos, hogy a lemezeket minimálisan mozgatni kell, mert a mozgás a citokin lokális diffúziójához és a foltok élességének elvesztéséhez vezethet.

Detection - Chromogenic vs. Fluorescent options

A stimulációt követően a sejteket eltávolítjuk, a lyukakat alaposan kimossuk, és egy második analit-specifikus Ab-t alkalmazunk. Ennél és minden további lépésnél a mosás kritikus fontosságú a sejtek, a nem specifikusan kötött Ab és a detektáló reagens teljes eltávolítása érdekében. A nem kötött reagensek nem teljes eltávolítása a háttérjel általános növekedéséhez vezet. A mosással és a spot kialakításával kapcsolatos lehetséges kihívásokkal a hibaelhárítás fejezetben (10. oldal) foglalkozunk.

Az ELISpot -vizsgálatok vagy közvetlenül a detektálási motívumhoz (enzim vagy fluorokróm) konjugált antitestekkel, vagy kétlépéses, biotin/streptavidin-konjugált Ab-párral végzett folyamatként végezhetők. Míg a kétlépéses eljárás a jelerősítésnek köszönhetően nagyobb intenzitást biztosít, és ezért előnyösebb lehet olyan esetekben, amikor az egy sejtre jutó citokintermelés alacsony (allergia/Th2-válaszok), ez a protokoll a bevonó Ab-vel való nem specifikus kölcsönhatás miatt a háttérfestés nagyobb lehetőségét is magában hordozza. Az enzimek, például a torma-peroxidáz (HRP) esetében egy kicsapó szubsztrátot (TMB vagy AEC) használnak a foltok kimutatásához. A HRP magas fluktuációs sebessége miatt a foltfejlődés gyors (≤5 perc). Ezzel szemben az alkalikus foszfatázzal konjugált Abs-sel történő foltfejlesztés sokkal lassabb, de lényegesen alacsonyabb háttérrel jár. A MultiScreen^®HTS lemezeken végzett kromogén vizsgálatoknál (az alulcsatornával ellátott lemezeknél) ajánlott az alulcsatornát eltávolítani a szubsztrát hozzáadása előtt; ennek elmulasztása magas háttérfestődést eredményezhet. Miután eltávolították, a lemezeket fel kell támasztani, hogy a membránnal való érintkezés minimálisra csökkenjen. A foltok jobb láthatóvá tétele érdekében a lemezeket fedő nélkül, fejjel lefelé fordítva, szobahőmérsékleten kell szárítani néhány órán keresztül. Hosszú távú tárolás esetén a lemezeket sötét, száraz helyen, szobahőmérsékleten kell tárolni, hogy a foltok kifehéredését megelőzzük.

Amint korábban már tárgyaltuk, a fluoreszcens konjugátumok használata jelentős előnyöket kínál a kolorimetriás rendszerekkel szemben, különösen a kettős citokin alkalmazások esetében, vagy ahol az egyes foltok nagyobb mennyiségi értékelése kívánatos. Míg a FITC- és Cy3-konjugált Abs-eket gyakran használják, a fluoreszcens szonda kiválasztását csak a konjugátumok és a detektálási platformok elérhetősége korlátozza.

Spotszámlálás és -elemzés - Mi az igazi spot?

Minden spot egy-egy sejt "citokin szignatúráját" képviseli. A diffúziós tulajdonságok miatt egy valódi foltnak sűrűn színezett közepe van, amely a szélek felé halványul; a foltok méretét és/vagy színintenzitását a felszabaduló citokin mennyisége határozza meg. A mért analit, az inkubációs idő, az antitest-koncentráció, az enzimaktivitás, a szubsztrátok és más felhasznált anyagok, valamint a citokin-kiválasztó sejtek funkcionális állapota közötti különbségek miatt a foltok mérete és sűrűsége nagymértékben változhat. Előfordulhatnak mesterséges foltok, amelyeket az antitestek aggregációja vagy a sejtek és sejttörmelék nem teljes eltávolítása okozhat. Morfológiailag ezeket a foltokat a színintenzitásuk homogenitása és élesebb (nem lekerekített) széleik alapján lehet megkülönböztetni a "valódi" foltoktól.

A fenti leírás alapján a fénymikroszkópos manuális foltszámlálás egy rendkívül szubjektív, a felhasználók közötti nagyfokú variabilitással járó folyamatnak minősül. Továbbá, ha figyelembe vesszük, hogy egy standard vakcinakísérlet során milyen nagyszámú kutat kell számszerűsíteni, az ELISpot adatelemzés feladata emberi szem számára túlságosan is fáradságos feladattá válik. A kifinomult ELISpot -olvasók elérhetősége teljes megoldást kínál a spot-adatok pontos kiértékelésére. Ezek a műszerek olyan funkciókat tartalmaznak, amelyekkel leküzdhetők a változó háttérintenzitással kapcsolatos problémák, és amelyek képesek megkülönböztetni a valódi egyedi sejtfoltokat a műtermékektől. Ez utóbbi képesség a folt méretére és intenzitására vonatkozó minimális és maximális küszöbértékek használatán alapul, amelyek lehetővé teszik a gyenge járulékos válaszok és a több sejtet tartalmazó klaszterek kizárását. A sebességen túl a spotelemző szoftverek a folyamatok szabványosítását is lehetővé teszik, ami kritikus fontosságú, ha a vizsgálatokat több helyszínen végzik, mint például a diagnosztikai vizsgálatok és a vakcinakísérletek esetében. Az ELISpot -olvasók és az elemzőszoftverek továbbá lehetővé teszik a foltok pontosabb mérését, lehetővé téve több citokin szekréciójának kvantitatív meghatározását sejtenként.

A Troubleshooting Guide for Interpreting and Correcting Ambiguous Elispot Result

1. Magas szintű háttérfestés

Kérdés	Megoldás vagy magyarázat
A sejteket az inkubációs lépés előtt megmosták?	A mosás megakadályozza a szekretált citokinek átvitelét az inkubációt megelőző közegbe.
A másodlagos/detektáló antitestet a felhasználás előtt szűrték?	A Steriflip®  (katalógusszám: SE1M003M00) vagy Millex® szűrők (katalógusszám: SLHV033RS) használatával végzett antitest-szűrés csökkenti a háttérfestést vagy a fehérjeaggregátumok miatt esetlegesen fellépő hamis pozitív foltokat.
Az ajánlott mosási lépések száma a vizsgálat során végbement?		Mivel a lemezmosók kevésbé erőteljesek, mint a kézi módszerek, ezért lemezmosó használata esetén a standard mosási lépések számának 1,5-szeresét javasoljuk.
Szteril technikát és reagenseket alkalmaztak a vizsgálat elvégzése során?		A kultúrában lévő szennyeződések nem specifikus háttérfestést eredményezhetnek.
A membrán az elemzés előtt teljesen megszáradt?		A nedves/nedves membránok sötétkék háttérszínt jeleníthetnek meg. Az egy éjszakán át tartó, 4 °C-on történő szárítás növelheti a háttér és a foltok közötti kontrasztot. A 37 °C-nál magasabb hőmérsékleten történő szárítás a membránok repedezését okozhatja.
Mozgatták/ütögették a lemezt az inkubáció során?		A diffúzió miatt háttérfestés vagy diffúz foltok keletkezhetnek, ha a lemezeket a sejtinkubációs lépés során mozgatják.
Az élő/elhalt sejtek százalékos arányát az inkubáció előtt megbecsülték?		Az elhalt sejtek magas száma magas háttérfestést és/vagy foltok hiányát eredményezheti.
Optimalizálták-e a sejtek beültetési sűrűségét a vizsgálat megkezdése előtt?	A bemeneti sejtszám és az ingerek koncentrációjának előzetes optimalizálását javasoljuk.
A másodlagos/detektáló antitest koncentrációját, az enzimkonjugátumot (HRP-Streptavidin vagy AP-Streptavidin) és az enzimszubsztrátot optimalizálták a vizsgálat megkezdése előtt?		A biotiniilált másodlagos/detektáló antitest vagy az enzimkonjugátum feleslegessége valószínűleg hozzájárul a háttérhez. A reagensek koncentrációjának vagy a reakcióidőnek a csökkentése csökkenti a hátteret.
A PBS-t a használat előtt szűrték?		Egyes PBS-készítményeknél előnyös lehet a használat előtti 0,2 µM szűrővel történő szűrés.

2. Nincsenek foltok/üres kutak

Kérdés		Megoldás vagy magyarázat
Megtörtént-e a membrán előnedvesítése? A membrán szürke/átmenetes lett az előnedvesítés után?				A nem megfelelő előnedvesítés a jel hiányát, nem festődő területeket vagy rosszul definiált foltokat eredményezhet a rossz befogadó Ab kötődés miatt. Győződjön meg róla, hogy a 35%-os EtOH közvetlenül a használat előtt készült, és valóban 35%-os oldat (nem a 95%-os EtOH 35%-a).
A megfelelő antitestpárokat választotta ki?		Győződjön meg arról, hogy a befogadó és a detektáló Abs különböző antigén epitópokkal reagál.
A vizsgálat megkezdése előtt optimalizálták a sejtbeültetés sűrűségét?		A foltok hiánya azt jelezheti, hogy a reagáló sejtek gyakorisága nagyon alacsony.
Megfelelően stimulálta az érdeklődésre számot tartó citokint/fehérjét?			A T-sejtválaszok esetében javasoljuk, hogy pozitív kontrollként poliklonális aktivátort, például PHA-t használjon.
Sárgává változott a táptalaj a stimuláció során?			Ha igen, akkor a sejtek nagy százalékában apoptotikus/necrotikus sejthalál következhetett be.
A sejteket az Elispot lemezre való hozzáadás előtt egyetlen sejtszuszpenzióba reszuszpendálták?			A csomósodás a foltképző sejtek alulbecsléséhez és következetlen eredményekhez vezethet.
A sejteket megfelelően tárolták a stimulálás előtt?			A sejtek életképességét a tenyésztés beállítása és a stimulálás előtt kell értékelni. Javasoljuk a guava easyCyte™ benchtop áramlási citometriás rendszert és a ViaCount® reagenset
A PBST (PBS + 0.5% Tween® 20) használták a foltfejlesztés előtti utolsó mosáshoz?			A tisztítószerek, mint például a Tween®-20, gátolhatják az enzimreakciókat. A végső mosási lépésekhez csak "PBS-t" használjon.

3. Elmosódott/gyengén definiált/folyékony foltok

Kérdés		megoldás vagy magyarázat
Végeztek-e előnedvesítési lépést?		Az előnedvesítés nem alkalmazható általánosan minden Elispotra; követelménye a befogadó Ab inherens hidrofobicitásától függ; ezért az előnedvesítési protokollt az alkalmazás előtt optimalizálni kell.
Az elsődleges/befogadó antitest koncentrációját optimalizálták a vizsgálat megkezdése előtt?		A nagy, diffúz foltok gyakori oka a nem elegendő befogadó antitest. Jó gyakorlat az optimális Ab-koncentráció meghatározása a használat előtt. A validált készletek használata biztosítja, hogy minden reagenskoncentráció optimális legyen.
A lemezeket egymásra helyezték az inkubációs lépés során?			A lemezek egymásra helyezése befolyásolhatja a hő egyenletes eloszlását a lemezeken vagy az egyes kutakban.
A fejlesztő reagenseket használat előtt hagyták szobahőmérsékletre jutni?			A HRP és az AP enzimatikus reakció(k) szobahőmérsékleten működnek optimálisan. A rosszul definiált foltok a hideg szubsztrát hozzáadása miatti alulfejlődés következményei lehetnek.
Az inkubációs időt optimalizálták a vizsgálat megkezdése előtt?		Minél tovább inkubálják a sejteket, annál több citokint/fehérjét választanak ki, ami nagyobb foltokat eredményez, amelyek kezdenek összeolvadni és megkülönböztethetetlenné válni. Az inkubációs idő változhat (18-48 óra) a sejttípustól és az érdeklődésre számot tartó citokintől/fehérjétől függően. A stimuláns mennyisége is optimalizálást igényelhet.
A leolvasás előtt hagyták-e teljesen megszáradni a lemezt?		A 4 °C-on történő éjszakai szárítás segíthet a háttér és a foltok közötti kontraszt növelésében.

Köszönet

Köszönjük Tomas Ernemarnak (Mabtech) a FluoroSpot adatok biztosítását és a kézirat átnézését. A 384 lyukú adatokat Jodie Hansen (CTL) bocsátotta rendelkezésünkre. Szeretnénk köszönetet mondani Sylvia Janetzkinek (ZellNet Consulting) a kézirat átnézéséért.

Hivatkozások

1. Czerkinsky CC, Nilsson L, Nygren H, Ouchterlony Ö, Tarkowski A. 1983. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65(1-2):109-121. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90308-3

2. Sedgwick J, Holt P. 1983. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57(1-3):301-309. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90091-1

3. Starita-Geribaldi M, Sudaka P. 1990. Fast electrotransfer of human serum proteins in their native state from polyacrylamide thin gradient gels reinforced by textiles to polyvinylidene difluoride membranes.. Rapid electrotransfer from thin gradient gels reinforced by textiles. Bioseparation.. 1(2):111-117. https://europepmc.org/article/med/1368164

4. Wahlgren M. 1991. Protein adsorption to solid surfaces. Trends in Biotechnology. 9(1):201-208. https://doi.org/10.1016/0167-7799(91)90064-o

5. Helms T, Boehm BO, Asaad RJ, Trezza RP, Lehmann PV, Tary-Lehmann M. 2000. Direct Visualization of Cytokine-Producing Recall Antigen-Specific CD4 Memory T Cells in Healthy Individuals and HIV Patients. J Immunol. 164(7):3723-3732. https://doi.org/10.4049/jimmunol.164.7.3723

6. Schlingmann TR, Shive CL, Targoni OS, Tary-Lehmann M, Lehmann PV. 2009. Increased per cell IFN-? productivity indicates recent in vivo activation of T cells. Cellular Immunology. 258(2):131-137. https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2009.04.002

7. Hesse MD, Karulin AY, Boehm BO, Lehmann PV, Tary-Lehmann M. 2001. A T Cell Clone?s Avidity Is a Function of Its Activation State. J Immunol. 167(3):1353-1361. https://doi.org/10.4049/jimmunol.167.3.1353

8. Alix-Panabieres C, Riethdorf S, Pantel K. 2008. Circulating Tumor Cells and Bone Marrow Micrometastasis. Clinical Cancer Research. 14(16):5013-5021. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-07-5125

9. Davis MM, Bjorkman PJ. 1988. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334(6181):395-402. https://doi.org/10.1038/334395a0

10. Arstila TP. 1999. A Direct Estimate of the Human T Cell Receptor Diversity. 286(5441):958-961. https://doi.org/10.1126/science.286.5441.958

11. Sun Y, Iglesias E, Samri A, Kamkamidze G, Decoville T, Carcelain G, Autran B. 2003. A systematic comparison of methods to measure HIV-1 specific CD8 T cells. Journal of Immunological Methods. 272(1-2):23-34. https://doi.org/10.1016/s0022-1759(02)00328-9

12. Schmittel A, Keilholz U, Scheibenbogen C. 1997. Evaluation of the interferon-? ELISPOT-assay for quantification of peptide specific T lymphocytes from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 210(2):167-174. https://doi.org/10.1016/s0022-1759(97)00184-1

13. Streeck H, Frahm N, Walker BD. 2009. The role of IFN-? Elispot assay in HIV vaccine research. Nat Protoc. 4(4):461-469. https://doi.org/10.1038/nprot.2009.7

14. Jakobson E, Masjedi K, Ahlborg N, Lundeberg L, Karlberg A, Scheynius A. 2002. Cytokine production in nickel-sensitized individuals analysed with enzyme-linked immunospot assay: possible implication for diagnosis. Br J Dermatol. 147(3):442-449. https://doi.org/10.1046/j.1365-2133.2002.04850.x

15. Ewen C, Baca-Estrada ME. 2001. Evaluation of Interleukin-4 Concentration by ELISA Is Influenced by the Consumption of IL-4 by Cultured Cells. Journal of Interferon & Cytokine Research. 21(1):39-43. https://doi.org/10.1089/107999001459141

16. Lehmann PV, Zhang W. 2012. Unique Strengths of ELISPOT for T Cell Diagnostics.3-23. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-325-7_1

17. Rininsland FH, Helms T, Asaad RJ, Boehm BO, Tary-Lehmann M. 2000. Granzyme B ELISPOT assay for ex vivo measurements of T cell immunity. Journal of Immunological Methods. 240(1-2):143-155. https://doi.org/10.1016/s0022-1759(00)00191-5

18. Kleen TO, Asaad R, Landry SJ, Boehm BO, Tary-Lehmann M. 2004. Tc1 effector diversity shows dissociated expression of granzyme B and interferon-? in HIV infection. AIDS. 18(3):383-392. https://doi.org/10.1097/00002030-200402200-00003

19. Kuerten S, Nowacki TM, Kleen TO, Asaad RJ, Lehmann PV, Tary-Lehmann M. 2008. Dissociated Production of Perforin, Granzyme B, and IFN-? by HIV-Specific CD8+ Cells in HIV Infection. AIDS Research and Human Retroviruses. 24(1):62-71. https://doi.org/10.1089/aid.2007.0125

20. Snyder JE, Bowers WJ, Livingstone AM, Lee FE, Federoff HJ, Mosmann TR. 2003. Measuring the frequency of mouse and human cytotoxic T cells by the Lysispot assay: independent regulation of cytokine secretion and short-term killing. Nat Med. 9(2):231-236. https://doi.org/10.1038/nm821

21. Brunner K, Mauel J, Cerottini J, Chapuis B. 1968. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells of 51Cr-labelled allogeneic target cells in vitro;. Inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology.. 14(2):181. https://europepmc.org/article/med/4966657

22. Ghanekar SA, Nomura LE, Suni MA, Picker LJ, Maecker HT, Maino VC. 2001. Gamma Interferon Expression in CD8+ T Cells Is a Marker for Circulating Cytotoxic T Lymphocytes That Recognize an HLA A2-Restricted Epitope of Human Cytomegalovirus Phosphoprotein pp65. Clin. Diagn. Lab. Immunol.. 8(3):628-631. https://doi.org/10.1128/cdli.8.3.628-631.2001

23. Horton H, Russell N, Moore E, Frank I, Baydo R, Havenar?Daughton C, Lee D, Deers M, Hudgens M, Weinhold K, et al. 2004. Correlation between Interferon?? Secretion and Cytotoxicity, in Virus?Specific Memory T Cells. J INFECT DIS. 190(9):1692-1696. https://doi.org/10.1086/424490

24. Betts MR. 2006. HIV nonprogressors preferentially maintain highly functional HIV-specific CD8+ T cells. Blood. 107(12):4781-4789. https://doi.org/10.1182/blood-2005-12-4818

25. Snyder-Cappione JE, Divekar AA, Maupin GM, Jin X, Demeter LM, Mosmann TR. 2006. HIV-Specific Cytotoxic Cell Frequencies Measured Directly Ex Vivo by the Lysispot Assay Can Be Higher or Lower Than the Frequencies of IFN-?-Secreting Cells: Anti-HIV Cytotoxicity Is Not Generally Impaired Relative to Other Chronic Virus Responses. J Immunol. 176(4):2662-2668. https://doi.org/10.4049/jimmunol.176.4.2662

26. Casey R, Blumenkrantz D, Millington K, Montamat-Sicotte D, Kon OM, Wickremasinghe M, Bremang S, Magtoto M, Sridhar S, Connell D, et al. Enumeration of Functional T-Cell Subsets by Fluorescence-Immunospot Defines Signatures of Pathogen Burden in Tuberculosis. PLoS ONE. 5(12):e15619. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015619

27. Sester U, Fousse M, Dirks J, Mack U, Prasse A, Singh M, Lalvani A, Sester M. Whole-Blood Flow-Cytometric Analysis of Antigen-Specific CD4 T-Cell Cytokine Profiles Distinguishes Active Tuberculosis from Non-Active States. PLoS ONE. 6(3):e17813. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017813

28. Hirsch CS, Hussain R, Toossi Z, Dawood G, Shahid F, Ellner JJ. 1996. Cross-modulation by transforming growth factor beta in human tuberculosis: suppression of antigen-driven blastogenesis and interferon gamma production.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93(8):3193-3198. https://doi.org/10.1073/pnas.93.8.3193

29. Harris J, De Haro SA, Master SS, Keane J, Roberts EA, Delgado M, Deretic V. 2007. T Helper 2 Cytokines Inhibit Autophagic Control of Intracellular Mycobacterium tuberculosis. Immunity. 27(3):505-517. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2007.07.022

30. Tincati C, Cappione III AJ, Snyder-Cappione JE. Distinguishing Latent from Active Mycobacterium tuberculosis Infection Using Elispot Assays: Looking Beyond Interferon-gamma. Cells. 1(2):89-99. https://doi.org/10.3390/cells1020089

31. Boaz MJ, Hayes P, Tarragona T, Seamons L, Cooper A, Birungi J, Kitandwe P, Semaganda A, Kaleebu P, Stevens G, et al. 2009. Concordant Proficiency in Measurement of T-Cell Immunity in Human Immunodeficiency Virus Vaccine Clinical Trials by Peripheral Blood Mononuclear Cell and Enzyme-Linked Immunospot Assays in Laboratories from Three Continents. CVI. 16(2):147-155. https://doi.org/10.1128/cvi.00326-08

32. Streeck H, Lichterfeld M, Alter G, Meier A, Teigen N, Yassine-Diab B, Sidhu HK, Little S, Kelleher A, Routy J, et al. 2007. Recognition of a Defined Region within p24 Gag by CD8+ T Cells during Primary Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection in Individuals Expressing Protective HLA Class I Alleles. JVI. 81(14):7725-7731. https://doi.org/10.1128/jvi.00708-07

33. Altfeld M, Kalife ET, Qi Y, Streeck H, Lichterfeld M, Johnston MN, Burgett N, Swartz ME, Yang A, Alter G, et al. HLA Alleles Associated with Delayed Progression to AIDS Contribute Strongly to the Initial CD8+ T Cell Response against HIV-1. PLoS Med. 3(10):e403. https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0030403

34. Hanson J, Sundararaman S, Caspell R, Karacsony E, Karulin A, Lehmann P. ELISPOT Assays in 384-Well Format: Up to 30 Data Points with One Million Cells. Cells. 4(1):71-83. https://doi.org/10.3390/cells4010071

35. Weiss AJ. 2012. Overview of Membranes and Membrane Plates Used in Research and Diagnostic ELISPOT Assays.243-256. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-325-7_19

36. Smith JG, Liu X, Kaufhold RM, Clair J, Caulfield MJ. 2001. Development and Validation of a Gamma Interferon ELISPOT Assay for Quantitation of Cellular Immune Responses to Varicella-Zoster Virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol.. 8(5):871-879. https://doi.org/10.1128/cdli.8.5.871-879.2001

37. Kalyuzhny AE. 2009. ELISPOT Assay on Membrane Microplates.355-365. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-542-8_37

38. Currier JR, Kuta EG, Turk E, Earhart LB, Loomis-Price L, Janetzki S, Ferrari G, Birx DL, Cox JH. 2002. A panel of MHC class I restricted viral peptides for use as a quality control for vaccine trial ELISPOT assays. Journal of Immunological Methods. 260(1-2):157-172. https://doi.org/10.1016/s0022-1759(01)00535-x

39. Pitt A. 1987. The nonspecific protein binding of polymeric microporous membranes. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 41(3):110-113. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3612412/

40. Kreher CR, Dittrich MT, Guerkov R, Boehm BO, Tary-Lehmann M. 2003. CD4+ and CD8+ cells in cryopreserved human PBMC maintain full functionality in cytokine ELISPOT assays. Journal of Immunological Methods. 278(1-2):79-93. https://doi.org/10.1016/s0022-1759(03)00226-6

41. Ferrari G, Pollara J. 2004. Validating the Guava ViaCount® Assay, an Automated Cell Counting/Viability Method for Use in ELISpot Assays. EMD Millipore Corporation. Application Note Literature No. MK10441101