Sejtkultúra GYIK: Bakteriális endotoxin-szennyezés

Mi az endotoxin?

Az endotoxinok olyan kisméretű, baktériumokból származó hidrofób lipopoliszacharid (LPS) molekulák, amelyek könnyen szennyezhetik a laboratóriumi eszközöket, és amelyek jelenléte jelentősen befolyásolhatja mind az in vitro, mind az in vivo kísérleteket. Jelenlétüket a limulus amebocita lizátummal (LAL assay) lehet kimutatni, amely akár 0,01 endotoxin egység (EU)/ml értékig képes kimutatni. Az endotoxinok körülbelül 10 kDa méretűek, de könnyen alkotnak nagy, akár 1000 kDa méretű aggregátumokat. A baktériumok nagy mennyiségben bocsátanak ki endotoxint sejtpusztuláskor, valamint aktív növekedésük és osztódásuk során. Egyetlen Escherichia coli körülbelül 2 millió LPS-molekulát tartalmaz sejtenként. Az endotoxinok nagy hőstabilitással rendelkeznek, így a szokásos sterilizálási körülmények között lehetetlen elpusztítani őket. Ezek amfipatikus molekulák, amelyek oldatban nettó negatív töltést hordoznak. Hidrofób jellegük miatt valószínűleg erős affinitással rendelkeznek más hidrofób anyagokhoz, például a laboratóriumban használt műanyag termékekhez. Ezért gyakori a laboratóriumi főzőpoharakból, keverőpálcákból és egyéb laboratóriumi eszközökből származó szennyeződések átvitele.

Figure 1. Structure and physical properties of bacterial endotoxin. Endotoxins are complex lipopolysaccharides (LPS) present in the outer cell membrane of gram-negative bacteria. Endotoxins consist of a core polysaccharide chain, O-specific polysaccharide side chains (O-antigen) and a lipid component, Lipid A, which is responsible for the toxic effects.

Mi a különbség az endotoxin és az exotoxin között?

Mindkettő potenciálisan veszélyes a sejtkultúrákra. Az exotoxinok a baktériumok által szekretált és a sejten kívülre kibocsátott toxikus anyagok, általában fehérjék. Míg az endotoxinok olyan baktériumtoxinok, amelyek lipidekből állnak, és a baktérium sejtfalában helyezkednek el. Az exotoxinok általában hővel elpusztíthatók, míg az endotoxinok magas hőmérsékleten nem pusztíthatók el. Az exotoxinok nagy antigénnel rendelkeznek és immunválaszt váltanak ki, míg az endotoxinok nem.

Hogyan vizsgálják az endotoxint?

A limulus amebocita lizátum teszt (LAL-teszt) a leggyakrabban használt endotoxin-teszt. A (patkósrákból származó) LAL a bakteriális endotoxinnal, a lipopoliszachariddal (LPS), amely a gram-negatív baktériumok membránkomponense, gélrögöt képezve reagál, amely számszerűsíthető. Az endotoxint milliliterenkénti endotoxinegységben (EU/ml) mérik. Egy EU körülbelül 0,1-0,2 ng endotoxin/mL oldatnak felel meg. Jelenleg a LAL-próbának három formája létezik, mindegyik különböző érzékenységgel. A LAL gélrögös vizsgálat 0,03 EU/ml-ig képes kimutatni, míg a LAL kinetikus turbidimetriás és kromogén vizsgálatok 0,01 EU/ml-ig képesek kimutatni.

Figure 2. LAL assay test principle. The cascade of endotoxin detection in Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay starts when the endotoxin LPS reacts with Factor C in and turn, activates the factor B. Factor B turns the gel-forming pro-enzyme into an enzyme. The resulting clotting enzyme is responsible for anchoring the two peptide units in the coagulogen, forming an insoluble gel. Other compounds which also cause the gelation in the amebocyte lysate of the horseshoe crab can interference in the test of bacterial endotoxins. Some of these compounds are (1,3)-β-D-glucans, which lead to false positives in the LAL test.

Melyek a laboratóriumban előforduló endotoxinszennyezés gyakori forrásai?

A sejttenyésztő laboratóriumban az endotoxinszint jelentős csökkentéséhez elengedhetetlen az összes laboratóriumi eszköz, a tápfolyadék nyersanyagok és a megfelelő laboratóriumi technikák alapos tisztasága. Ajánlott továbbá az összes táptalajt szűrőszűréssel sterilizálni egy olyan szűrőberendezéssel, mint a Stericup^® szűrőegység, amely a sejtekhez való bevezetés előtt képes az összes potenciális endotoxint eltávolítani.

• Víz: A nagy tisztaságú víz minden laboratóriumban elengedhetetlen. A Milli-Q^® Integral víztisztító rendszer ultratiszta endotoxinmentes vizet biztosít a laboratóriumoknak, közvetlenül a csapvízből. A rendszer akár 300 l/nap tiszta és/vagy ultratiszta víz előállítására képes, ami a legtöbb laboratórium igényeit kielégíti. Ezenkívül egyszer használatos palackokban kínálunk endotoxinmentes vizet minden sejttenyésztési alkalmazáshoz.
• Serum: Biológiai állati eredetéből adódóan a magzati szarvasmarha-szérum történelmileg az endotoxinok egyik fő bűnösének számított. A jobb szűrés azonban jelentősen csökkentette a kockázatokat. Szérumunk minden tételét endotoxinszint-tesztnek vetettük alá, hogy biztosítsuk a magas szintű teljesítményt.
• Cellkultúra-reagensek: Az olyan gyakori reagensek, mint a Ecoli. -ból származó rekombináns növekedési faktorok, hormonok, lipidek, alapközegek és disszociációs reagensek, mint a tripszin, mind endotoxin forrást jelenthetnek. Minden sejtkultúrában tesztelt reagensünket endotoxinszintre teszteljük.
• Műanyagáruk/üvegáruk: Az üvegeszközöknek, műanyag csöveknek és szerelvényeknek pirogénmentesnek kell lenniük, az újrafelhasználható eszközöket pedig pirogénmentes vagy alacsony endotoxinszintű vízzel kell öblíteni. A műanyag palackokat gammasugárzással kell sterilizálni.
• A felhasználó szennyeződése: A baktériumok a bőr, a haj és a nyál minden felületén jelen vannak. Ezért a sejtkultúrák kezelése során megfelelő aszeptikus technikára van szükség, hogy minimálisra csökkentsük az endotoxin rendszerbe való bevitelének kockázatát.

Milyen hatással van az endotoxin a sejtkultúrákra?

Az endotoxinok mind in vitro mind in vivo a sejtek növekedésére és működésére hatással vannak, és jelentős változékonyság forrását jelentik. In vitro egyre több bizonyíték van arra, hogy az endotoxin számos problémát okoz a sejttenyésztési kutatásokban. A dokumentált hatások között szerepel a leukocita kultúrák szöveti faktorok termelésére való serkentése, az IL-6 indukált termelése ló makrofágokban, valamint az egér eritroid kolóniaképződés gátlása nagyon alacsony (1 ng/ml-nél kisebb) endotoxinszintek által. In vivo, az endotoxinok gyulladásos választ váltanak ki állatkísérletekben. Az endotoxin jelenléte az injekciós termékekben (vakcinák és injekciós gyógyszerek) pirogén reakciókat eredményezhet, amelyek a láztól és hidegrázástól a visszafordíthatatlan és halálos szeptikus sokkig terjedhetnek.

Melyek az endotoxin elfogadható határértékei a sejtkultúrákban?

Az endotoxin-szennyezéssel kapcsolatos súlyos kockázatok miatt az amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság (FDA) az orvostechnikai eszközök és parenterális gyógyszerek endotoxin-koncentrációjára vonatkozó határértékeket állapított meg, amelyekkel a kutatóknak tisztában kell lenniük. Az FDA jelenlegi határértékei szerint az orvostechnikai eszközökből származó eluátumoknak 0,5 EU/ml-nél kisebbnek kell lenniük, kivéve, ha az eszköz cerebrospinális folyadékkal érintkezik, ahol a határérték 0,06 EU/ml.

Hogyan lehet megelőzni az endotoxinszennyezést?

Elkerülhetetlen, hogy megbízható reagensszállítótól származó, endotoxinra tesztelt reagenseket, kiegészítőket és táptalajokat használjon. Fontos továbbá a megfelelő aszeptikus technikák alkalmazása, valamint a sejttenyésztés előtt alaposan kiöblíteni és sterilizálni minden sejttenyésztő műanyag edényt és fogyóeszközt, például pipettákat és kúpos csöveket.

Hogyan lehet eltávolítani az endotoxint, ha a tenyészetek szennyezettek?

El kell dobni az összes reagenseket és sejteket, ha a tenyészetek endotoxinnal szennyeződnek, és új reagensekkel és sejtekkel kell kezdeni. Ha azonban a mintát nem lehet kidobni, akkor a reagensek felhasználhatók az eltávolításukra. Ezek a endotoxin eltávolító oldatok a Triton X-114 micelláris tulajdonságaira támaszkodnak az LPS endotoxinok eltávolítása érdekében a mintákból.