Mikrobiológiai bevezetés
Bővebben
- Mikrobiális-növekedési követelmények
- .Fizikai / környezeti tényezők
- Mikroorganizmusok taxonómiája és azonosítása
- A mikrobák növekedésének nyomon követése
- Baktériumkultúrák megőrzése
- Hivatkozások & amp; Irodalom
Minden mikrobiológus eredeti célja a mikrobakultúrák reprodukálható növekedése, függetlenül attól, hogy a mikroorganizmusok természetes eredetűek vagy az ember által genetikailag manipuláltak. A reprodukálható növekedéshez meghatározott környezeti feltételek szükségesek az energiaforrás, a hőmérséklet, a pH és a tápanyagok tekintetében (Microbial Growth Requirements). Ezt szem előtt tartva olyan termékek és szolgáltatások sorát kínáljuk (lásd a tenyésztési gyűjtemények listáját, a táptalajok összehasonlítását stb.), amelyek az általános mikrobiológusok és a szakemberek igényeit egyaránt kielégítik.
Mikroorganizmusok
A mikroorganizmusok közé sorolt szervezetek csoportjában vannak egyszerű egysejtű formák (kokcik, bacilusok, virio és spirillák), valamint többsejtű formák (fonalak és burok). A csoportba tartoznak a kék zöld algák (cianobaktériumok), a gombák, az őslábúak és a baktériumok.
A túléléshez és a növekedéshez a mikroorganizmusoknak energiaforrásra és táplálékra van szükségük. A baktériumok a mikroorganizmusok legprimitívebb formái, de egyszerű és összetett molekulák nagy változatosságából állnak, és a kémiai átalakulások széles skáláját képesek végrehajtani. Igényeiktől és a felhasznált energiaforrástól függően különböző táplálkozási csoportokba sorolják őket.
1. ábra.
A mikroorganizmusok mérete a csak elektronmikroszkópban látható vírusok esetében a μM töredékétől a fonalas algák vagy gombák esetében például több cm-es méretig terjed:
Mikrobák növekedési követelményei
A mikrobák növekedéséhez megfelelő környezeti feltételek, energiaforrás és táplálék szükséges. Ezek a követelmények két kategóriába sorolhatók: fizikai és kémiai.
Kémiai tényezők
Táblázat a mikrobiális növekedéshez szükséges, a természetben megtalálható elemekről, összehasonlítva a mikrobiológiai közegbe juttatott kémiai formákkal.
*Ezek pufferként is működnek.
1A vas oldatban való szolubilizációjának vagy megtartásának megkönnyítése érdekében komplexképző szerek, például EDTA vagy citrát adható a közeghez.
Fizikai/környezeti tényezők
Hőmérséklet
A legtöbb mikroorganizmus jól növekszik az ember, a magasabb rendű növények és az állatok által kedvelt normál hőmérsékleten. Bizonyos baktériumok azonban olyan hőmérsékleten (extrém meleg vagy hideg) nőnek, amelyen kevés magasabb rendű szervezet képes túlélni. A baktériumokat az általuk preferált hőmérsékleti tartománytól függően három csoportba soroljuk: A pszichrofilok (hidegkedvelő mikroorganizmusok), amelyek főként az óceánok mélyén, a jégben és a hóban, valamint a sarkvidékeken élnek, optimális növekedési hőmérsékletük 0 °C és 15 °C között van, és a maximális növekedési hőmérsékletük nem haladja meg a 20 °C-ot. A vízben, talajban és magasabb rendű szervezetekben található mezofil (mérsékelt hőmérsékletet kedvelő baktériumok) a vizsgált mikrobák leggyakoribb típusa. Optimális növekedési hőmérsékletük 25 °C és 40 °C között van. Számos patogén baktérium optimális hőmérséklete 37 °C, így a mezofilok alkotják a legtöbb gyakori romlást okozó és betegséget okozó mikrobánkat. A termofilok (hőt kedvelő mikrobák) magas hőmérsékleten képesek növekedni, optimumuk 60 °C felett van. Egyes organizmusok a víz forráspontjához közeli hőmérsékleten, sőt nyomás alatt 100 °C felett is növekednek. A legtöbb termofil nem képes 45 °C alatt növekedni.
PH
A legtöbb baktérium olyan környezetben növekszik a legjobban, ahol a pH-érték szűk, semlegességhez közeli tartományban, 6,5 és 7,5 közötti pH-értékek között van. Azokat, amelyek szélsőséges pH-értékek között növekednek, acidofil (savkedvelő) vagy alkalinofil (báziskedvelő) baktériumoknak nevezzük. Az acidofil baktériumok 4 alatti pH-értékeken növekednek, és néhány baktérium még 1 pH-értéknél is aktív. Az alkalinofil baktériumok a 9-10 pH-értékeket kedvelik, és a legtöbbjük nem képes semleges vagy annál alacsonyabb pH-értékű oldatokban növekedni. A baktériumok növekedése során gyakran szerves savak szabadulnak fel a közegbe, amelyek csökkentik annak pH-értékét, és így akadályozzák vagy teljesen gátolják a további növekedést. Bár az olyan gyakori táptalaj-összetevők, mint a peptonok és aminosavak kis mértékben pufferelnek, a legtöbb bakteriológiai táptalajban külső pufferre van szükség a savak semlegesítéséhez és a megfelelő pH-érték fenntartásához. A foszfát-sók a leggyakrabban használt pufferek, mivel a legtöbb baktérium növekedési tartományában pufferelnek, nem mérgezőek és foszforforrást, egy alapvető tápelemet biztosítanak. A magas foszfátkoncentrációnak azonban az a hátránya, hogy súlyos tápanyaglimitációt eredményezhet, amit az oldhatatlan fémfoszfátok (például vas) kicsapódása okozhat a közegben.
Ozmotikus nyomás
A mikrobák körülbelül 80-90%-ban vizet tartalmaznak, és ha magasabb oldott anyagkoncentrációjú oldatba kerülnek, vizet veszítenek, ami a sejt zsugorodását (plazmolízis) okozza. Egyes baktériumok azonban olyan jól alkalmazkodtak a magas sókoncentrációhoz, hogy a növekedéshez valóban szükségük van rá. Ezeket a baktériumokat halofileknek (sóimádóknak) nevezik, és a sókban vagy olyan területeken találhatók, mint a Holt-tenger.
2. ábra:
Az oxigén
Azokat a mikrobákat, amelyek az oxigént energiahasznosításra használják, aeroboknak nevezzük, ha az anyagcseréjükhöz oxigénre van szükségük, akkor obligát aeroboknak. Az obligát aerobok hátrányos helyzetben vannak, mert az oxigén rosszul oldódik vízben, és a környezet nagy része hiányt szenved ebben a szükséges elemben. Gyakran előfordul, hogy az aerob baktériumok megőrizték azt a képességüket, hogy oxigén nélkül is képesek növekedni; ezeket fakultatív anaeroboknak nevezzük. Azokat a baktériumokat, amelyek nem képesek az oxigén felhasználására, sőt, károsodhatnak általa, obligát anaeroboknak nevezzük. További csoportok: a mikroaerofilok, amelyek olyan aerob mikrobák, amelyek csak egy szűk sávban tűrik az oxigénkoncentrációt, amely általában alacsonyabb, mint a légköré, és ezért gyakran nehéz őket laboratóriumban tenyészteni, valamint az aerotoleráns baktériumok, amelyek oxigén jelenlétében növekednek, de nem igénylik azt.
Víz
A magasabb rendű szervezetekkel ellentétben a mikroorganizmusok anyagcseréje a víz jelenlététől függ. A mikroorganizmusok igényei a rendelkezésre álló vízzel szemben igen eltérőek. A szilárd anyagok és oldatok rendelkezésre álló víztartalmának összehasonlításához hasznos paraméterek a vízaktivitás vagy a relatív páratartalom.
Szén-dioxid
Az autotróf anyagcserében a mikrobák különböző energiaforrásokat és redukáló erőt csapdáznak, amelyeket a CO2 szerves vegyületekké történő redukciójára használnak. Ha autotróf CO2-fixáló mikroorganizmusokat akarnak termeszteni, akkor általában nátrium-hidrogén-karbonátot adnak a táptalajhoz, és az inkubációt zárt edényekben, szén-dioxid-tartalmú légkörben végzik, vagy alternatívaként levegő vagy szén-dioxiddal dúsított levegő keringtetése történik az edényben. Míg egyes kemoautotrófok aerobok, amelyek végső elektronakceptorként oxigént használnak, és az energiát különböző szervetlen elektrondonorok légzéséből nyerik, más mikroorganizmusok anaerob légzést folytatnak, és az oxigéntől eltérő szervetlen végelektron-akceptort használnak. A heterotróf (= szerves szénforrásokat asszimiláló) mikroorganizmusok szén-dioxidot is igényelnek. Számos, a vérben, szövetekben vagy a bélrendszerben élő baktérium alkalmazkodott a normál levegőnél magasabb szén-dioxid-tartalomhoz. Ezeket a baktériumokat ezért 10%(vol) szén-dioxidot tartalmazó légkörben inkubálják. A fototróf baktériumok obligát anaerobok, és a fény energiáját olyan reakciók sorozatához használják fel, amelyek a szén-dioxidot trióz-foszfáttá és más sejtalkotóvá alakítják. Bár a szén-dioxidot inkább újrahasznosítják, mint asszimilálják, szinte minden növekvő sejtnek abszolút igénye van a megfelelő pCO2-ra. Ezért fontos megjegyezni, hogy a szén-dioxid eltávolítása pl. KOH-abszorpcióval gátolja szinte minden baktérium növekedését.
Mikrobiológiai tenyésztési módszerek & mikroorganizmusok izolálása a természetből
A mikroorganizmusok természetes környezetükből számos technikával izolálhatók. Ha a mikrobapopulációk gyakoriak, sűrűek vagy elég nagyok, akkor steril tamponnal vagy hurokkal közvetlenül mintát lehet venni belőlük, és megfelelő folyékony táptalajba oltani, vagy agarlemezre csíkozni. Ez különösen az olyan orvosi mintákra vonatkozik, amelyekben az organizmusok nagy számban és lokalizált területeken vannak jelen. A nagy mikrobapopulációkat tartalmazó környezeti minták, pl. talaj, közvetlenül is hozzáadhatók egy megfelelő táptalajhoz. Ahol a mikroorganizmusok ritkán fordulnak elő, ott előzetes dúsítási leállításra van szükség. Ez a minták szűrésével és a szűrők megfelelő közegben történő inkubálásával érhető el. A szűrést általában folyékony minták (pl. folyó- és tengervíz) és levegő mintavételekor alkalmazzák. A környezeti minták in-situ mintavétele olyan technikákat foglal magában, mint az eltemetett tárgylemez vagy az eltemetett kapilláris módszer, amely során a mikroszkópos tárgylemezeket vagy a megfelelő közeggel bevont kapilláriscsöveket a természetes környezetbe (talajba vagy üledékbe) temetik, és csak bizonyos idő elteltével kerülnek elő. A tárgylemezeket vagy kapillárisokat ezután friss táptalajba helyezik, és az organizmusokat szubkultúrázzák. Ezeket a módszereket akkor alkalmazzák, ha az organizmusok lassan növekednek, különleges körülményeket igényelnek, vagy ha a környezet minimális zavarására van szükség.
Minden minta szubkultúrázható a bemutatott mikrobiológiai tenyésztési módszerek bármelyikének alkalmazásával.
3. ábra.
A mikroorganizmusok taxonómiája és azonosítása
A taxonómia az egyedek csoportokba sorolásának elmélete és gyakorlata. A taxonómiai módszereknek három csoportja van:
Numerikus taxonómia
Ezt úgy határozzuk meg, mint "a taxonómiai egységek numerikus módszerekkel történő csoportosítása taxonokba jellemzőik alapján". Ez magában foglalja a baktériumok összes élettani jellemzőjének vizsgálatát egy sor biokémiai és tenyésztési teszt segítségével, mint például: a lebontott szerves vegyületek sokfélesége, a különböző vitaminok vagy koenzimek iránti igény, festési reakciók és a növekedés antibiotikumokkal való meggátlása. Az eredményeket számítógépen kódolják, és az egyedek közötti kapcsolatokat dendrogram formájában fejezik ki. A rendszertani besorolásnak ez a formája nem utal a baktériumtörzsek közötti evolúciós kapcsolatra. A kereskedelemben ma már számos ilyen tesztet tartalmazó készletek kaphatók, amelyek megkönnyítik a baktériumok számos csoportjának azonosítását.
Kémiai taxonómia
Az egyedek csoportosítása itt egy sor, feltehetően közös őstől örökölt tulajdonság alapján történik. A kémiai taxonómia esetében a baktériumokat a baktériumok szerkezeti összetevői közötti kémiai hasonlóság alapján csoportosítják. A leggyakrabban használt anyagok a fehérjék, amelyek az evolúció során jól megőrződő molekulák. A közös ősök megállapításához a kemotaxonómusok általában az enzimek elsődleges szerkezetét, a peptidoglikánt, a citoplazmamembránt és annak zsírsavösszetételét, a külső membránt és az anyagcsere végtermékeit elemzik.
Molekuláris taxonómia
Ez a kromoszómális DNS vagy a riboszómális RNS genetikai szekvenciáinak összehasonlítása a hasonlósági minták és egy csoport filogenetikai fejlődésének megállapítására. Bár a DNS purin (G, guanin; A, adenin) és pirimidin (C, citozin; T, timin) bázisok tartalma egyedenként változik, egy adott fajon belül állandó marad. A G+C-tartalom ezért felhasználható taxonómiai kapcsolatok megállapítására.
A 16S vagy 23S riboszómális RNS szekvenciái közötti hasonlóságokat is összehasonlítják egy baktériumcsoport filogenezisének tanulmányozása céljából.
Az antimikrobiális érzékenység vizsgálata
A vegyület antimikrobiális aktivitását általában a vegyület azon legkisebb koncentrációjának mérésével határozzák meg, amely a vizsgált mikroorganizmus növekedésének gátlásához szükséges (MlC-minimális gátló koncentráció). A vizsgálatok az antibiotikum mikrobiális közegen keresztül történő diffúziójára támaszkodnak, hogy gátolják a benne vagy rajta növekvő fogékony organizmus növekedését. A gátlási zónákat a mikroba érzékenységét reprezentatívnak tekintik. Az antibiotikum-érzékenységet sok éve használják az osztályozás és az azonosítás jellemző módszereként.
Anaerob növekedés
A szigorúan anaerob baktériumok termesztése különleges problémát jelent, mivel ezeket a baktériumokat a levegővel való érintkezés elpusztíthatja. A közegben oldott oxigén a metabolikus elektronok jelenlétében mérgező szabad gyököket és hidrogén-peroxidot képez. Az obligát anaerobok nem képesek az oxigén ezen aktív formáinak méregtelenítésére. A nem szigorú anaerobok szilárd táptalajon történő tenyésztéséhez anaerob edényeket használnak gázfejlesztő "Gas-Paks" -okkal együtt, amelyek CO2 és H2-t is kibocsátanak. A hidrogén egy palládium-katalizátor jelenlétében oxigénnel reagál, és vizet termel, így eltávolítja az oxigént az edényből. A kereskedelemben kaphatók a szigorú (obligát) anaerobok tenyésztésére használt, légzsilipekkel ellátott és inert gázokkal töltött teljesen anaerob kamrák.
Redoxpotenciál (O/R-potenciál)
Ez az oxidált és redukált molekulák aránya egy közegben: amikor például oxigén oldódik egy közegben, a jelenlévő szerves vegyületek oxidáltabbá válnak, és a közeg pozitív redoxpotenciált mutat. Ahogy a mikrobiális növekedés felemészti az oxigént, a közeg negatívabb redoxpotenciál felé mozdul el. A szigorúan anaerobok megkövetelik, hogy a közeget a növekedés során nagyon alacsony (negatív) potenciálon tartsák. Ennek elérése érdekében az autoklávozás előtt redukálószereket adnak a közeghez. Gyakran használt redukálószerek a nátrium-tioglikolát (HS-CH2COONa) vagy a nátrium-ditionit, amelyek könnyen adnak protonokat más vegyületeknek. A redoxpotenciál, a pH és a mikrobák növekedése közötti kapcsolatot az alábbiakban szemléltetjük.
4. ábra.
Eh- és pH-tartományok a mikrobák növekedéséhez (Zajic 1969-től átvéve): az ábrát olyan jelentésekből állítottuk össze, amelyekben a pH és az Eh értékeket is megadták a növekedési viselkedéshez. Nagyon valószínű, hogy a csoportok növekedési tartományai túlmutatnak az ábrán látható határokon.
Mikrobiális növekedés monitorozása
Mikrobiális növekedés monitorozása.
5. ábra
Sorozatos hígítások
Az inokulumot hígítócsövek sorozatában hígítjuk, amelyeket kiültetünk. A lemezen lévő telepek számát megszámoljuk, és a hígítással korrigálva kiszámítjuk az eredeti oltóanyagban lévő organizmusok számát.
Most Probable Number Method
Egy statisztikai módszer megbecsüli a hígítási sorozat készítéséhez használt oltóanyagban lévő baktériumok legvalószínűbb számát. Több sorozatot készítenek különböző kezdeti inokulummennyiségekkel; az eredményeket a pozitívumok sorozataként rögzítik, azaz a csőben történő növekedés, amelyből kiszámítható az MPN. Az eredmény a mikroorganizmusok valószínűsíthető száma, amely várhatóan ezt az eredményt adja.
Direkt mikroszkópos megfigyelés
Kifejezetten erre a célra készített mikroszkópos tárgylemezeket használnak, amelyeken egy ismert térfogatú sekély mélyedés és egy üvegbe maratott rács található. A mélyedést megtöltjük a baktériumszuszpenzióval, és meghatározzuk a baktériumok átlagos számát az egyes rácsnégyzetekben, majd megszorozzuk egy tényezővel, hogy megkapjuk a milliliterenkénti számot. A szelektív festést (fluoreszcens festékeket alkalmazva) arra használják, hogy a környezeti mintákban a baktériumokat megkülönböztessék az élettelen anyagoktól. Elektronikus sejtszámlálók is kaphatók, amelyek automatikusan megszámolják a mért folyadékmennyiségben lévő sejtek számát.
Homályosság (optikai sűrűség)
A folyékony közeg zavarossága a baktériumok szaporodásával növekszik, és spektrofotométerrel mérhető. A detektorba jutó fény mennyisége fordítottan arányos a baktériumok számával standardizált körülmények között. A minta abszorbanciája (optikai sűrűség) a sejtek számától, méretétől és alakjától függ, és a baktériumok növekedésének ábrázolására szolgál. Ha az abszorbancia-méréseket összevetjük ugyanannak a kultúrának a közvetlen számlálásával, fehérjetartalmával vagy száraz tömegével, akkor a korreláció felhasználható a baktériumok számának vagy biomasszájának későbbi, közvetlenül a zavarossági méréseken alapuló becsléséhez.
Metabolikus aktivitás
A baktériumok számának becslésére egy másik közvetett módszer a populáció metabolikus aktivitásának felhasználása. Egy anyagcsere-termék mennyiségét mérik, és feltételezik, hogy az arányos a jelenlévő baktériumok számával. Az anyagcsere-termékek közé tartoznak például a CO2 és a szerves savak. Az oxigénfelvétel redukciós teszttel is mérhető, például a metilénkék festék használatával, amely oxigén jelenlétében kékről színtelenre változik oxigén hiányában.
Baktériumkultúrák tartósítása
Konzerválás
Rövid távú tárolásra használható. Az agarlemezre csíkozott kultúrák vagy szúrótenyészetek 4 °C-on tárolva több hónapig is életképesek lehetnek. A lemezeket le kell zárni, hogy megakadályozzák kiszáradási hajlamukat. A tenyészetek hosszabb ideig történő tartósítására általában két módszert alkalmaznak:
Mélyfagyasztás
A tiszta baktériumtenyészetet folyadékban szuszpendálják, és -50 °C és -95 °C közötti hőmérsékleten (gyakran folyékony nitrogénnel) gyorsfagyasztják. Az érzékeny mikroorganizmusok védelmére glicerin (15-20 %-os végkoncentráció) jelenlétére van szükség, amely "fagyálló", vagy extra fehérje (sovány tejpor) jelenlétére. A kultúrák felolvaszthatók és akár több év múlva is felhasználhatók.
Lyophilizálás
A baktériumok szuszpenzióját gyorsan lefagyasztják, és a vizet nagy vákuummal eltávolítják. A mikrobák ebben a porszerű maradványban több évig is életben maradnak, és a tenyészet tápközegben történő rehidratálásával bármikor újraéleszthetők. A törzsgyűjteményekből rendelt baktériumtörzseket általában ebben a formában szállítják.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?