Ortogonális építőelemek kiválasztása

A Novabiochem^® termékpaletta az ortogonálisan és kvázi-ortogonálisan védett háromfunkciós aminosavak egyik legnagyobb gyűjteményével rendelkezik. Ezek a származékok hasznos eszközök ciklikus és elágazó peptidek, valamint oldallánc-módosításokat hordozó peptidek szintéziséhez. A Novabiochem^® szelektíven védett aminosavainak tulajdonságait az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat. Szelektív védőcsoportok Fmoc SPPS-hez

	Szerkezet	Eltávolította	Módszer	Szabályozás	Szabályozás
O-All/Alloc		3 eq. Pd(Ph3P)4 in CHCl3/AcOH/NMM  (37:2:	Módszer 4	TFA, piperidin, hidrazin
Azido		3 eq. Me3P in dioxán/víz	5. módszer	TFA, piperidin
STmp			β-Mercaptoethanol, 0.1 NMM DMF-ben	7. módszer	7. módszer	TFA (részleges), piperidin
N-xDde			2% hidrazin DMF-ben vagy 20% hidroxilamin/ 15% imidazol NMP/DCM-ben (5:	1. módszer		TFA, piperidin, Pd(0), DBU
O-Dmab
O-Dmab			2% hidrazin DMF-ben<	1. módszer		TFA, piperidin, Pd(0), DBU/td>
S-Mmt			2% TFA DCM-ben, 1-5% TIS-t tartalmazó DCM-ben		6. módszer		Pd(0), hidrazin, piperidin
N-Mtt			1% TFA DCM-ben, 1-5% MeOH-t tartalmazva	2. módszer		Pd(0), hidrazin, piperidin
N-Mmt		0.6 M HOBt DCM/TFA-ban (1:	3. módszer		Pd(0), hidrazin, piperidin
O-2-(PhiPr)				2% TFA DCM-ben, 1-5% TIS-t tartalmazó DCM-ben	6. módszer		Pd(0), piperidin
O-Trt			1% TFA 1-5% TIS-t tartalmazó DCM-ben	6. módszer		Pd(0), hidrazin, piperidin
O-2-ClTrt			1% TFA 1-5% TIS-t tartalmazó DCM-ben	6. módszer	Pd(0), hidrazin, piperidin

Diaminopropionsav/butánsav, ornitin és lizin származékok

Fmoc-Dpr(ivDde)-OH, Fmoc-Dab(ivDde)-OH, Fmoc-Orn(ivDde)-OH, Fmoc-Lys(ivDde)-OH, ivDde-Lys(Fmoc)-OH.

Fmoc-Dpr(Mtt)-OH, Fmoc-Dab(Mtt)-OH, Fmoc-Orn(Mtt)-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH

Fmoc-Lys(Mmt)-OH

Dde/ivDde

A Dde¹ és ivDde² amino-védőcsoportok 1993-as, illetve 1998-as bevezetése óta az Fmoc/xDde stratégia vált az elágazó, ciklikus és oldallánc-módosított peptidek Fmoc SPPS-szel történő szintézisének standard megközelítésévé, és több mint 200 publikációban hivatkoznak e védőcsoportok használatára³.

A stratégia hasznossága abból a tényből ered, hogy a Dde és ivDde-védett primer aminok 20%-os piperidinnel és TFA-val szemben stabilak, de 2%-os hidrazin DMF-ben hasadnak. Így az e csoportokkal védett aminocsoportok szelektíven leleplezhetők a szilárd fázisban anélkül, hogy más maradékok oldalláncvédő csoportjait befolyásolnák, megkönnyítve a későbbi helyspecifikus módosítást. A reakció továbbá spektrofotometriával is nyomon követhető, mivel az indazol hasadási termék 290 nm-en erősen elnyelődik (1. ábra).

1. ábra. Az ivDde eltávolítása

Az Fmoc/Dde stratégia alkalmazására a következő példák találhatók: elágazó¹ és di-epitopikus peptidek⁴, ciklikus peptidek^5,6, TASP molekulák⁷./sup>, fluoreszcensen jelölt peptidek⁸, multifunkcionális szondák⁹ és ubikinált peptidek¹⁰.

A Dde vagy ivDde közötti választás az alkalmazástól függ. A Dde könnyebben eltávolítható, mint az ivDde, de sokkal kevésbé robusztus. Megfigyelték, hogy a Dde az N-ε-Fmoc-Lys és az N-terminális Dpr-maradékok piperidinnel közvetített leválasztása során vándorláson megy keresztül, ami a peptidláncon belüli pozíciójának összekeveredéséhez vezet; és hosszú szekvenciák szintézise során részleges elvesztését tapasztalták¹¹. A nehezebb ivDde-csoport ezzel szemben nem megy át jelentős mértékben kimosódáson vagy oldallánc-migráción, kivéve a Dpr¹² speciális esetét, de esetenként rendkívül nehéznek bizonyulhat az eltávolítása, különösen, ha a peptid Cvégződésén vagy a szekvencia egy aggregált régiójában található.

A lizinből rendelkezésre állnak olyan Fmoc-származékok, amelyekben az α- és ε-aminocsoportok Dde-vel és ivDde-vel védettek: Fmoc-Lys(Dde)-OH, Dde-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-Lys(ivDde)-OH; és ivDde-Lys(Fmoc)-OH. A Dpr és a Dab esetében csak az ivDde-védett oldalláncú származékok állnak rendelkezésre: Fmoc-Dpr(ivDde)-OH és Fmoc-Dab(ivDde)-OH.

Mivel a hidrazin az Fmoc-, valamint a Dde- és ivDde-csoportokat is képes eltávolítani, a ciklikus vagy oldalláncosan módosított peptidek Fmoc/Dde stratégiával történő előállításakor a peptidgerinc összeállítását általában a Dde/ivDde-csoportok védtelenítése előtt fejezik be. A peptid N végét Boc-kal kell védeni, ami történhet a N peptid közvetlen beépítésével.Nvégső maradék Boc-védett aminosavként vagy a szabad Nvégső aminocsoport Boc₂O-val történő acilezésével.

A Dde vagy ivDde eltávolítása általában a gyanta 2%-os hidrazin DMF-ben történő kezelésével érhető el, bár olyan esetekben, amikor az ivDde eltávolítása nehéznek bizonyult, akár 10%-os hidrazin oldatokat is alkalmaztak. A folyamat spektrofotometriásan követhető ugyanazon a hullámhosszon, amelyet az Fmoc eltávolításának ellenőrzésére használunk, mivel a Dde vagy ivDde csoport hidrazin reakcióterméke egy kromofór indazol-származék (1. ábra). A Dde és ivDde a Boc hasításhoz használt szokásos reagensekkel (TFA vagy 50%-os TFA DCM-ben) és a DBU-val szemben is stabil az Fmoc eltávolításához használt szokásos koncentrációban (kb. 2%).

Ha az ivDde csoport közel van a peptid Cvégződéséhez vagy a peptid aggregálódott, az ivDde eltávolítása nagyon lassú és gyakran nem teljes. A probléma elkerülhető az oldallánccal módosított lizint tartalmazó peptidek esetében, ha Fmoc-Lys(ivDde)-OH helyett ivDde-Lys(Fmoc)-OH-t használunk az említett maradékok beépítéséhez. Az előbbi használata lehetővé teszi, hogy a lizin oldallánc-módosítása a lánchosszabbítás során történjen. Az ivDde-Lys(Fmoc)-OH peptidláncba történő beépítését követően az oldallánc Fmoc-csoportja piperidinnel eltávolítható, az oldallánc aminocsoportja a kívánt karbonsav-funkcionalizált részegységgel reagálhat, mielőtt az ivDde hidrazin segítségével eltávolítanánk, és a lánc meghosszabbítása a szokásos módon történne.

A Dde és az Fmoc teljes ortogonalitását kimutatták, ha a hidroxilamin-hidroklorid/imidazol (1.3:1) NMP-ben hidrazin helyett DMF-ben hidrazin helyett Dde eltávolítására¹³ használunk.

1. módszer: A Dde/ivDde szelektív eltávolítása 2% hidrazin DMF-ben

Batch

1. Tegyük a peptidil-gyantát egy lombikba, és kezeljük 2% hidrazin-monohidráttal DMF-ben (25 ml/g). Zárjuk le a lombikot, és hagyjuk állni rt-en 3 percig.
2. Szűrjük le a gyantát, és ismételjük meg a hidrazinos kezelést még két alkalommal.  A részben védett gyantát mossuk ki DMF-fel.

Folyamatos áramlás

1. Folyatassunk 2% hidrazin-monohidrátot DMF-ben 3 ml/perc sebességgel az 1 cm átmérőjű reakcióoszlopba csomagolt peptidil-gyantán keresztül.  A fehérjebontást az oszlop eluensének abszorbanciáját 290 nm-en spektrofotometriásan nyomon követhetjük 0.1 mm-es úthosszúságú küvettával.
2. Amikor a reakció befejeződött, amit az abszorbancia eredeti értékére való visszatérése jelez, öblítsük át az oszlopot DMF-fel.

Mtt

Az Mtt csoport eltávolítható a lizin vagy az ornitin oldalláncáról 1% TFA-val DCM¹⁴ -ben vagy DCM/HFIP/TFE/TES (6.5:2:1:0,5) (2. módszer), lehetővé téve a szelektív eltávolítást más oldalláncvédő csoportok jelenlétében, amelyek eltávolításához akár 95%-os TFA-ra van szükség. TFA használata esetén 1-5% TIS vagy MeOH hozzáadása ajánlott a felszabaduló tritil-kationok elfojtására. Az előzetes eredmények azt mutatják, hogy a MeOH-s tisztítás megakadályozza a t-butilcsoportok elvesztését és a Rink-amidgyanták idő előtti lehasadását¹⁵  (2b. módszer).

2. módszer: Az Mtt eltávolítása a Lys-ből szilárd fázisban

a) DCM/HFIP/TFE/TES

1. Adjunk DCM/HFIP/TFE/TES-t (6.5:2:1:0,5) (20 ml/g gyanta) a peptidil-gyantához.
2. A keveréket hagyjuk állni enyhe keverés mellett 1 órán át.
3. Vegyünk ki egy kis mintát a gyantából és mossuk ki DCM-mel. Adjunk 1%-os TFA-t DCM-ben a gyantamintához. Ha azonnal narancssárga szín keletkezik, akkor hagyja a reakciót további egy órán át.
4. Ha a tritylteszt negatív, mossa a gyantát DMF-fel, 10% DIPEA-t DMF-ben, DMF-fel és használja fel a szintézis következő lépésében.

b) TFA/DCM/MeOH

1. Adjunk TFA/DCM/MeOH-t (1:98:1) (15 mg/ml) a peptidil-gyantához. 1 perc múlva engedjük le.
2. Adjunk friss TFA/DCM/MeOH-t (1:98:1) (15 mg/ml) a peptidil-gyantához, és hagyjuk állni 16 órán át.
3. Mossuk a gyantát DMF-fel, 10% DIPEA-t DMF-ben, DMF-fel és használjuk fel a szintézis következő lépésében.

Mmt

Az Mmt csoportot lényegesen könnyebb eltávolítani, mint az Mtt-et. A lizin oldalláncáról gyorsan leválasztható az Mtt esetében leírt módszerekkel, de még AcOH/TFE/DCM (1:2:7)¹⁶ vagy HOBt in DCM/TFE (3. módszer) segítségével is eltávolítható. Az Fmoc-Lys(Mmt)-OH használata ideális azokban az esetekben, amikor az Mtt eltávolítása problémás. Az Mmt csoport rendkívüli savérzékenysége miatt az Fmoc-Lys(Mmt)-OH kapcsolása a PyBOP^®/DIPEA vagy más bázisok által közvetített kapcsolási módszerekkel a legjobb.

3. módszer: Az Mmt-csoport eltávolítása

1. Adjunk hozzá 0.6 M HOBt-t DCM/TFE-ben (1:1) a DCM-ben duzzadt gyantához.
2. 1 órán át óvatosan keverjük; az oldat sötétvörösre színeződik.
3. Az oldószert szűréssel eltávolítjuk, és az 1. és 2. lépést megismételjük.
4. A gyantát szűréssel eltávolítjuk, DMF-fel mossuk és azonnal felhasználjuk a szintézisben, vagy tovább mossuk DCM-mel, majd MeOH-val, szárítjuk és tároljuk későbbi felhasználásra

.

Alloc

Az Alloc csoport stabil a piperidinnel és TFA-val történő kezeléssel szemben, de enyhe körülmények között könnyen eltávolítható Pd(0)-katalizált allil-transzferrel¹⁷. Erre a lépésre számos módszert alkalmaztak, de talán a leghasznosabb Kates, et al módszere. Pd(Ph₃P)₄/CHCl₃/HOAc/NMM¹⁸  (4. módszer) felhasználásával. Az Alloc csoport nem kompatibilis az ivDde¹⁹ eltávolítására alkalmazott feltételekkel. Úgy gondolják, hogy a hidrazinban lévő kis mennyiségű diazin jelenléte az allilcsoportban lévő kettős kötés redukcióját okozza. Szerencsére ez a mellékreakció könnyen leküzdhető, ha a hidrazinreagenshez alil-alkoholt adunk.

4. módszer: Az allok/allil védőcsoportok eltávolítása

Ez a reakció levegőre érzékeny, ezért minden manipulációt Ar alatt kell végezni.

1. A peptidilgyantát mérjük be egy kémcsőbe, és 40°C-on, nagy vákuumban szárítsuk meg. Zárjuk le a csövet egy gumiszeptummal. Öblítsük át az edényt a szeptumon keresztül bevezetett tűn keresztül adagolt Ar-árammal.
2. Mérjük be a Pd(PPh₃)₄ (3 ekv.) egy száraz kémcsőbe, adjunk hozzá CHCl₃-AcOH-N-metilmorfolin (37:2:1) (15 ml/g gyanta), oldjuk fel a katalizátort úgy, hogy Ar-áramot buborékosítunk az oldaton keresztül, és zárjuk le a csövet egy gumiszeptummal.
3. Ezt a keveréket egy Ar-val átöblített gázzáró fecskendővel juttassuk át a gyantát tartalmazó csőbe. Hagyjuk állni 2 órán át, időnkénti enyhe keverés mellett.
4. A gyantát vigyük át egy szinterezett üvegtölcsérbe, és a katalizátor eltávolítása érdekében mossuk át egymás után 0,5% DIPEA-val DMF-ben és nátrium-dietil-ditiokarbamáttal (0,5% m/m) DMF-ben.

A fenti eljárás bármely olyan automatizált peptidszintetizátoron is elvégezhető, amely N₂ keverést használ a reagensek oldásához és átviteléhez. A Pd(PPh₃)₄ katalizátort egy aminosav patronba kell bemérni és CHCl₃-AcOH-N-metilmorfolin (37:2:1) CHCl₃-AcOH-N-metilmorfolin (37:2:1) oldatban Ar keverés mellett feloldani. A patront le kell zárni, és a szokásos módon be kell helyezni a műszer automatikus töltőjébe. A műszert ezután úgy kell programozni, hogy a fiola tartalmát további reagensek hozzáadása nélkül juttassa át a reakcióedénybe vagy oszlopba. Ha a műszer rendelkezik tartalék oldószertartállyal, ezeket meg lehet tölteni 0,5% DIPEA-val DMF-ben és nátrium-dietil-ditiokarbamáttal (0,5% m/m) DMF-ben, hogy lehetővé tegye a gyanta automatikus mosását az alil-deprotekciót követően.

Megjegyzés: Ha az N-terminális Fmoc-csoportot az allil-észter leválasztása után eltávolítjuk, vagy ha a ciklizáláshoz karbodiimidet használunk, akkor a gyantát HOBt/DMF-fel is mosni kell.

Azidok

Azidok enyhe körülmények között tiolokkal vagy foszfinokkal a megfelelő aminokká redukálhatók. Ezért az oldallánc-azido funkcionalitást hordozó Fmoc-védett aminosavak hasznos eszközök elágazó és oldallánc-módosított peptidek előállításához. Az azidocsoport stabil a kapcsolási körülményekkel és a piperidinnel való kezeléssel szemben. A TFA hasítási körülményekkel szemben is stabil, feltéve, hogy a koktélból²⁰ kihagyjuk a tiolokat. Az azid redukciója a szilárd fázisban szelektíven leleplezi az oldallánc-aminocsoportot anélkül, hogy más aminosav-maradékokat érintene^{21, 22}.

5. módszer: Azidocsoport redukciója a szilárd fázison

1. Mossuk a gyantát háromszor dioxánnal és dioxán/vízzel (4:1).
2. Csapoljuk le a gyantát és adjunk hozzá 1 M Me₃P-t toluolban (6 ekv.) dioxán/víz (4:1) keverékben. Óvatosan keverjük 30 percig.
3. Vegyünk ki egy kis mintát a gyantából és mossuk dioxánnal, majd DCM-mel. Adjunk hozzá 95%-os TFA-t, és hagyjuk hasítani 1,5 órán át. HPLC-vel analizáljuk az azidocsoport redukciójának teljességének ellenőrzésére.

Hse, Ser, Thr, Tyr és Cys származékok

Fmoc-Cys(Mmt)-OH

Fmoc-Hse(Trt)-OH

Fmoc-Ser(Trt)-OH

Fmoc-Thr(Trt)-OH

Fmoc-Tyr(2-ClTrt)-OH

2-ClTrt/Trt/Mmt

2-ClTrt, Trt és Mmt csoportok eltávolíthatók a Tyr, Hse/Ser/Thr ^{oldalláncokból.23} és Cys²⁴ -ból csak 1%-os TFA-val DCM-ben, az összes többi védőcsoportot érintetlenül hagyva (6. módszer). Ez lehetővé teszi egyetlen maradék szelektív leválasztását a későbbi oldallánc-módosításhoz. Több Ser, Thr vagy Tyr maradékot tartalmazó termékeknél a szelektivitás úgy lehetséges, hogy a módosítani kívánt maradék kivételével az összes többi ilyen maradékot beépítjük a t-butil-éterbe. A tritil-csoport eltávolítása egyensúlyi folyamat, ezért a tritil-kationok elszívásához szilánokat kell használni, vagy folyamatos áramlási üzemmódban kell az egyensúlyt hajtani. A Ser(Trt) esetében Coba, et al. ²⁵ leírta 20%-os diklór-ecetsav DCM-ben 10 percig történő használatát a Trt eltávolítására.  Ez az eljárás szélesebb körben is alkalmazható más tritil védett aminosavak leválasztására.

A Ser/Thr/Tyr származékok leggyakoribb alkalmazása foszfopeptidek előállítása posztszintetikus módszerrel, foszforamidit reagenssel.

Egy összehasonlító vizsgálatban tisztább termékeket kaptak az oldalláncos tritil védett aminosavakkal, mint a standard t-t-butil védett aminosavakkal²⁶.

6. módszer: Tritilcsoportok eltávolítása a szilárd fázison

Batch-wise módszer

1. A száraz gyantát (1 g) DCM-mel előkeverjük egy szinterezett üvegtölcsérben (csapos és dugóval ellátott típus). Távolítsuk el a felesleges DCM-et.
2. Adjunk hozzá 94:1:5 DCM/TFA/TIS (10 ml), zárjuk le a tölcsért és rázzuk 2 percig. Távolítsuk el az oldószert N₂ nyomás alkalmazásával.
3. Ismételjük meg a 2. lépést háromszor.
4. Mossuk le a gyantát DCM-mel és szárítsuk vákuumban.

Áramlásos módszer

1. A gyantát (1 g) előáztassuk DCM-mel, és csomagoljuk a reakcióoszlopba.
2. Pumpáljunk 1%-os TFA-t DCM-ben (2 ml/perc) a gyantán keresztül. A reakciót az oszlop eluátumának abszorbanciájának mérésével lehet követni egy 0,1 mm-es áramlási küvettával 460 nm-en^a.
3. Amikor a reakció befejeződött, amit az abszorbancia alapvonalra való visszatérése jelez, öblítsük át az oszlopot DCM-mel.

^aHa a peptid más tritil alapú védőcsoportokat tartalmaz, a Trt-csoportok lassú kioldódása miatt a szint nem tér vissza az alapértékre].

tButhio/STmp

Cys(tButhio)²⁷ vagy Cys(STmp)²⁸  beillesztése;maradékok szekvenciába történő beillesztése lehetővé teszi a tiolcsoport szelektív védtelenítését a szilárd fázisban, lehetővé téve a Cys-maradékok módosítását vagy a gyantán belüli diszulfidhíd kialakítását.

A t-butiltio-csoport stabil a TFA-val szemben, feltéve, hogy a tiolokat nem használják scavengerként a hasítási reakcióban. Ez tiolekkel vagy trialkilfoszfinokkal^{29, 30} történő redukcióval távolítható el. Nemrégiben Góngora-Benítez, és munkatársai ³¹ kimutatták a 20%-os β-merkaptoetanol, 0.1 M NMM DMF-ben a tbutil-tio szilárd fázison történő eltávolítására, ahol a β-merkaptoetanol önmagában vagy a foszfinok sikertelenek voltak.

A gyakorlatban azonban gyakran rendkívül nehéznek bizonyul a tButio csoport eltávolítása a szilárd hordozón. Ezért Albericio nemrégiben bevezette az STmp csoportot²⁸. Úgy tűnik, hogy az STmp csoport rendkívül könnyen eltávolítható enyhe tiolízissel, mivel Albericio négy STmp csoport eltávolításáról számolt be a szilárd fázison mindössze három 5 perces kezeléssel 0,1 M N-metilmorfolin (NMM) 5 %-os merkaptoetanolt tartalmazó DMF-ben (7. módszer).

7. módszer: STmp eltávolítása a gyantán tiolokkal

1. kezeljük a peptidgyantát 5% β-merkaptoetanollal, 0.1 NMM DMF-ben 5 percig rt-nél.
2. Mossuk a gyantát DMF-fel és ismételjük meg a tioolos kezelést még kétszer.

Asp- és Glu-származékok

Az orrtogonálisan és kvázi-ortogonálisan védett Asp- és Glu-származékoknak számos alkalmazása van a peptidszintézisben és a kombinatorikus kémiában. Az α-észterek különösen hasznosak a fej-farok ciklikus peptidek előállításához gyantán történő ciklizációval, míg a szelektíven védett β- és γ- Asp és Glu észtereit glikopeptidek és oldallánc-oldallánc vagy fej-oldallánc laktámhíddal hidalt peptidek szintézisében lehet felhasználni^{18, 31-36}

Allyl

Fmoc-Asp/Glu-OAll/Fmoc-Asp/Glu(OAll)-OH

Az allil-észterek stabilak a piperidinnel és TFA-val történő kezeléssel szemben, de enyhe körülmények között könnyen eltávolíthatók Pd(0)-katalizált allil-transzferrel¹⁸, ahogyan azt korábban az alloc-csoport esetében leírtuk (4. módszer).

Az allil-csoport nem kompatibilis az ivDde¹⁹ eltávolítására alkalmazott körülményekkel. Úgy gondoljuk, hogy a hidrazinban lévő kis mennyiségű diazin jelenléte az allilcsoportban lévő kettős kötés redukcióját okozza. Szerencsére ez a mellékreakció könnyen leküzdhető, ha a hidrazinreagenshez alil-alkoholt adunk.

Dmab

Fmoc-Asp-ODmab, Fmoc-Glu-ODmab

Fmoc-Asp(ODmab)-OH, Fmoc-Glu(ODmab)-OH

A Dmab-észtereket Prof. B. W. Bycroft és Dr. W. Chan, a Nottinghami Egyetem és a Novabiochem^® együttműködésében fejlesztették ki, hogy kiegészítsék a Dde amino-védelmet. A Dmab blokkoló csoport kialakítása a safety-catch elven és a p-aminobenzil-észterek ismert hajlamán alapul, hogy 1,6-elimináción menjenek keresztül ^37,38. A biztonsági fogást az ivDde csoport biztosítja, amely a szintézis során védi az instabil p-aminobenzilészter aminofunkcióját.

A levédés

A Dmab-védelem kvázi ortogonális az Fmoc/tBu stratégiához képest, mivel a Dmab-észterek 20%-os piperidinnel DMF-ben és TFA-val szemben stabilak, de 2%-os hidrazin DMF-ben perceken belül kvantitatívan hasadnak.  A Dmab eltávolítása kétlépcsős folyamatot foglal magában: a hidrazin kezelés kezdetben eltávolítja az N-ivDde csoportot; ezt követi a keletkező p-amino benzil-észter összeomlása, a karbonsav egyidejű felszabadulásával (2. ábra).

A védőtlenítési reakciót szakaszosan vagy folyamatos áramlással is el lehet végezni.  Az utóbbi esetben a reakció spektrofotometriásan nyomon követhető 290 nm-en az indazol melléktermék felszabadulását követve.  Az aminobenzil-rész lassú hasadása esetenként megfigyelhető^39-42, és úgy tűnik, hogy nagyon szekvenciafüggő. Ezekben az esetekben a hordozó mosása 20% DIPEA-val DMF/vízben (90:10)³⁹39 vagy 5 mM nátrium-hidroxiddal metanolban⁴² hatásosnak bizonyult. Mivel a hidrazin eltávolítja az Fmoc-ot, a peptidgerinc összeállítását a Dmab oldallánc leválasztása előtt be kell fejezni. A peptid N-terminálisát Boc-kal kell védeni.  Ezt vagy az N-terminális maradék közvetlen beépítésével, mint Boc-védett aminosav, vagy a szabad N-terminális aminocsoport Boc₂O-val történő acilezésével lehet elérni.

Fmoc-Asp-ODmab-ot alkalmaztak a pirrhocoricin⁴³ ciklikus analógjának, egy 29-meres fej-fej-fej ciklikus peptid⁴⁴ és klórfuszin peptid⁴⁵ előállítására.

2. ábra. A Dmab eltávolítása

2-PhiPr

Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH

Fmoc-Asp(O-2-PhiPr)-OH

A 2-fenilizopropil csoport (2-PhiPr)⁴⁶ 1%-os TFA-val eltávolítható az Asp és Glu oldalláncáról a 6. módszerben megadott protokoll szerint. Ennek a védőcsoportnak a Lys-en vagy Orn-on lévő Mtt-vel kombinált alkalmazása kiváló stratégiát biztosít az oldallánc-oldallánc-laktám-híddal rendelkező peptidek szintéziséhez. A Dmab és All csoportokkal ellentétben a 2-PhiPr csoport jelentős védelmet nyújt az aszpartimid képződéssel szemben, ami az Fmoc-Asp(O-2-PhiPr) származékot az erre a mellékreakcióra hajlamos ciklikus peptidek szintéziséhez teszi alkalmassá.

 

Hivatkozások

1. Bycroft, et al. BW. 1993. Journal of the Chemical Society. Chemical Communications. 778

2. Chhabra, et al. SR. 1998. Tetrahedron Letters. 39, 1603

3. Available from: http://scholar.google.co.uk/scholar?cites=7545760316968945982.; http://scholar.google.co.uk/scholar?cites=16073846467466700087

4. Ahlborg N. 1995. Journal of Immunological Methods.. 179, 269

5. Bloomberg, et al. G. 1993. Tetrahedron Letters. 34, 4709

6. Sharma Sea. 1999. The Journal of Peptide Research.( 53, 501):

7. Dumy Pea. 1994. Proc. 23rd European Peptide Symposium, H. Maia (Ed.), ESCOM, Leiden. 1995, pp. 307; 31 Dec 1993;

8. Hoogerhout Pea. 1999. The Journal of Peptide Research. 54, 436

9. Garanger Eea. 2008. Chemical Communications. 4792

10. Kumar, et. al. KSA. 2011. Bioconjugate Chemical. 22, 137

11. Augustyns, et al. K. 1998. The Journal of Peptide Research. 51, 127

12. Wilhelm, et al. R. Peptides for the New Millennium. Proc. 16th American Peptide Symposium. G. B. Fields, J. P. Tam & G. Barany (Eds), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 58

13. Diaz-Mochon, et al. JJ. 2004. Organic Letters. 6, 1127

14. Aletras, et al. A. 1995. International Journal of Peptide and Protein Research. 45, 488

15. Bourel, et al. L. 2000. Journal of Peptide Science. 6, 264

16. Matysiak, et al. S. 1998. Tetrahedron Letters. 39, 1733

17. Albericio, et al. F. 1993. Tetrahedron Letters. 34, 1549

18. Kates, et al. S. 1994. Peptides, Chemistry, Structure & Biology. Proc. 13th American Peptide Symposium; 31 Dec 1993; ESCOM, Leiden R. S. Hodges & J. A. Smith (Eds.). p. 113.

19. Rohwedder, et al. B. 1998. Tetrahedron Letters. 39, 1175

20. Schneggenburger, et al. PE. 2010. Journal of Peptide Science. 16, 10

21. Meldal, et al. M. 1997. Tetrahedron Letters. 38, 2531

22. Lundquist JT, Pelletier JC. 2001. Organic Letters. 3, 781

23. Barlos, et al. K. 1991. Tetrahedron Letters. 32, 471

24. Barlos, et al. K. 1992. Peptides 1992 . Proc. 22nd European Peptide Symposium; ESCOM, Leiden, 1993: C. H. Schneider & A. N. Eberle (Eds.). p. 283.

25. Coba, et al. MP. 2003. Journal of Peptide Research. 61, 17

26. Barlos, et al. K. 1998. The Journal of Peptide Research. 51, 194

27. Weber U, Hartter P. 1970. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 351, 1384

28. Postma, et al. TM. 2012. Organic Letters. 14, 5468

29. Ruegg UT, Gattner HG. 1975. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 356, 1527

30. Beekman, et al. NJCM. 1997. The Journal of Peptide Research. 50, 357

31. Góngora-Benítez, et al. M. 2011. Biopolymers. 96, 69

32. Albericio, et al. F. 1993. F. Albericio, et al (1993). Tetrahedron Letters.(34, 1549):

33. Albericio et al. F. 1992. European Peptide Symposium. Proc. 22nd European Peptide Symposium; ESCOM, Leiden, 1993: C. H. Schneider & A. N. Eberle (Eds.). p. 191.

34. Bannwarth, et al. W. 1992. Tetrahedron Letters. 33, 4557

35. N. A. Solé, et al. in Peptides, Chemistry, Structure & Biology. Proc. 13th American Peptide Symposium; ESCOM, Leiden, 1994: R. S. Hodges & J. A. Smith (Eds.). p. 93.

36. Flouzat, et al. C. 1997. Tetrahedron Letters. 38, 1191

37. Chan, et al. WC. 1995. Journal of the Chemical Society. Chemical Communications. 2209

38. Evans, et al. DJ. 1996. Poster 122 presented at the . 24th European Peptide Symposium,; Edinburgh:

39. Valldosera, et al. M. 2008. The Journal of Peptide Research Therapeutics. 14, 273

40. Medzihradszky, et al. KF. 2002. Letters in Peptide Science. 8, 1.

41. Johnson T. 2000. Journal of the Chemical Society. Perkin Trans.. 1, 2811

42. Conroy, et al. T. 2009. Organic & Biomolecular Chemistry. 7, 2255

43. Cudic, et al. M. 2000. Peptides 2000. Proc. 26th European Peptide Symposium; Éditions EDK Paris, 2001: J. Martinez & J.-A. Fehrentz (Eds). p. 203.

44. Cudic, et al M. 2000. Tetrahedron Letters. 41, 4527

45. Malkinson, et al. JP. 3002. Organic Letters. 5, 5051.

46. Dick, et al. F. 1996. Peptides 1996 , Mayflower Scientific Ltd.. Proc. of 24th European Peptide Symposium; Birmingham: R. Ramage & R. Epton (Eds.). p. 339.