Peptidkapcsoló reagensek útmutató

A szakasz áttekintése

• Related Materials
• In-situ Aktiváló-reagensek
• Foszfónium kontra urónium reagensek
• Az urónium és foszfónium kapcsolóreagensek összefoglalása
/a>
• Referenciák

A Novabiochem^® márka a piacon az in situ aktiváláshoz használt, kiváló minőségű kapcsolási reagensek egyik legkiterjedtebb választékát kínálja. A rendelkezésre álló reagensek ilyen sokasága mellett azonban nem mindig egyszerű kiválasztani az optimális csatolóreagenseket egy adott alkalmazáshoz. A kondenzációs reagensek a kapcsolási hatékonyság, a stabilitás, az oldhatóság vagy az aktív speciesek reaktivitása szempontjából különböznek.

In-situ aktiváló-reagensek

Az in situ aktiváló reagensek széles körben elterjedtek, mert könnyen kezelhetők, gyors reakciókat eredményeznek, még a sztérikusan akadályozott aminosavak között is, és alkalmazásuk általában mellékhatásoktól mentes. A legtöbbjük foszfónium- vagy aminium (korábbi nevén urónium) sókon alapul, amelyek egy tercier bázis jelenlétében a védett aminosavakat zökkenőmentesen képesek különböző aktivált fajokká alakítani (1. ábra). A Novabiochem^® kapcsolóreagensek tulajdonságait az 1. táblázat foglalja össze.

1. ábra. A leggyakrabban használt kapcsolási reagensekkel előállított aktív észterek.
P1A1 = TOTU, P1A2 = HBTU/TBTU, P1A3 = HCTU, P1A4 = HATU, P1A5 = TSTU
P2A1 = COMU
P3A1 = PyOxim, P3A2 = PyBOP, P3A3 = PyClock, P3A4 = PyAOP.

A leggyakrabban használt reagensek, a BOP, a PyBOP és a HBTU OBt-észtereket hoznak létre, és ezek széles körben alkalmazásra kerültek a rutin SPPS és az oldatszintézisben a nehéz kapcsolásokhoz. Olyan kapcsolási reagensek is rendelkezésre állnak, amelyek az OBt-nél reaktívabb észtereket hoznak létre. A legfontosabbak a HATU², PyAOP^1,3 és a HCTU⁴, PyClocK, amelyek bázis jelenlétében a karbonsavakat a megfelelő OAt, illetve O-6-ClBt észterekké alakítják. Ezek az észterek a HOAt és HO-6-ClBt HOBt-hoz képest alacsonyabb pKa értéke miatt reaktívabbak, mint OBt társaik. Továbbá a HOAt további előnye a piridin-nitrogén, amely anchiomerikus segítséget nyújt a kapcsolási reakcióhoz, így a HATU és a PyAOP az OBt-sorozat leghatékonyabb kapcsolási reagensévé válik.

A közelmúltban vezették be az Oxyma Pure távozócsoporton alapuló kapcsolási reagenseket, amelyek közül a leghasznosabbak a COMU^5,6 és a PyOxim⁷. Az e reagensek által létrehozott Oxyma-észterek relatív reaktivitására vonatkozó bizonyítékok nem egyértelműek. Az eredeti jelentések szerint ezek az Oxyma-alapú reagensek hatékonyabbak, mint a HOAt-alapúak, míg a mi házon belüli vizsgálataink⁸ szerint a HOAt-reagensek jobbak. Mindazonáltal az Oxyma-alapú reagensek mindig jobban teljesítenek, mint a HOBt (PyBOP, HBTU) és az O-6-ClBt (PyClocK és HCTU) alapúak. Az oxima alapú kapcsolási reagensek egyik különleges előnye, hogy nem a potenciálisan robbanásveszélyes triazolreagenseken alapulnak.

Kísérleteinkben úgy tűnik, hogy egy kapcsolási reagens hatékonysága szinte teljes mértékben az általa létrehozott aktív észter jellegével függ össze, a reakcióképesség sorrendje OAt> Oxyma Pure > 2-ClOBt > OBt.  Úgy tűnt, hogy az urónium- vagy foszfóniumkomponens szerkezete kevéssé befolyásolja.

Foszfónium versus urónium-reagensek

A COMU kivételével az urónium-alapú reagensek DMF-ben lévő oldatai rendkívül stabilak, így ideálisak a kapcsolóreagensek előre elkészített oldatait használó szintetizátorokon való használatra. Ezzel szemben a foszfónium-reagensek DMF-ben lévő oldatai mérsékelten stabilak, ezért azokat zárt üvegekben kell tartani, és csak legfeljebb 2 napig szabad használni. A foszfóniumreagensek azonban lényegesen jobban oldódnak DMF-ben, mint az uróniumreagensek. Ennek fontos gyakorlati következményei vannak, mivel lehetővé teszi, hogy a reakciókat nagyobb koncentrációban végezzük el, és ezzel párhuzamosan javul a hatékonyság.

A foszfónium-kapcsolási reagensek általában tisztább reakciókat eredményeznek, mint az urónium-reagensek. Az utóbbiak a Nvégső aminocsoport⁹ guanidinyilálásával láncvégződéseket okozhatnak. Ez a mellékreakció különösen problematikus, ha a karboxilaktiválás lassú, például a fragmentálási és ciklizációs reakciók esetében, vagy ha felesleges uróniumreagens kerül alkalmazásra. Az ilyen melléktermékek képződése hosszú peptidek összeállításánál is nehézségeket okoz, mivel ezek a rövid pozitív töltésű peptidek elfedhetik a célion jelenlétét az ESI tömegspektrumban.  Az uróniumreagensekkel ellentétben a foszfóniumreagensek feleslegben is használhatók, és akár egy lassú ciklizációs vagy fragmentum-kapcsolási reakció "táplálására" is felhasználhatók, hogy segítsék azok befejezéséhez.

2. ábra. Urónium-kapcsoló reagensek által okozott guanidiniláció.

1. táblázat A Novabiochem^® kapcsolóreagensek tulajdonságainak összefoglalása

Kapcsoló reagens	Prod. No.	Szerkezet	Oszolvékonyság (M)	Szabályozhatóság DMF-ben zárt üvegben		Az aktív speciesek reaktivitása	Kommentárok
BOP/td>	851004		>1.5	n/a	4		Vízben oldódó melléktermékek teszik hasznossá oldatfázisú szintéziseknél
COMU	851085			1.5	alacsony	1/2		Nagy reakcióképesség, akadályozott csatolásoknál valószínűleg jobb, mint a HATU. Nem robbanékony. Korlátozott oldatstabilitás. Guanidilációt okoz.
HATU	851013			0.45	Kiváló	1	Az akadályozott csatolások arany standardja, de más reagensekhez képest drága
HBTU	851006				0.5	Kiváló	4		Rutinszintézishez kiváló reagens. Guanidinilációt okozhat.
HCTU	851012				0.75	Kiváló	3		Reaktívabb és drágább, mint a HBTU. Guanidinilációt okozhat.
PyBOP	851009			>1.5	Mérsékelt. Az oldatokat naponta frissen kell készíteni	4		Rutinszintézishez kiváló reagens. Ideális az in situ aktiváláshoz, mivel nem okoz guanidinilációt. Tiszta.
PyAOP	851221			>1.5	alacsony - mérsékelt. Az oldatokat naponta frissen kell elkészíteni. Legjobb N2	1		Kiváló reagens akadályozott csatolásokhoz, fragmentkondenzációhoz és peptidciklizációhoz. Ideális az in situ aktiváláshoz, mivel nem okoz guanidinilációt. Tiszta.
PyOxim	851095			>1.5	Mérsékelt. Az oldatokat naponta frissen kell készíteni	1/2		A PyBOP-hoz hasonló előnyökkel jár, de reaktívabb aktív fajokat hoz létre. Tiszta.
TSTU	851206			n/a	Kiváló	4	Hasznos a színezékek/PEG reagensek vízzel kompatibilis OSu észterekké történő átalakításához

Az urónium- és foszfónium-kapcsoló reagensek összefoglalása

Uronium	Foszfónium
Készletoldatokat használó szintetizátorok, különösen, ha az oldatok a légkör felé nyitva vannak	Szintetizátorok, ahol az oldatokat zárt tartályokban tartják és a reagensek gyorsan fogynak
Méretnövelés, ha a reagensek ára szempont	Méretnövelés, ha a reagensek koncentrációja szempont
Méretnövelés, ha a reagensek koncentrációja szempont
Nem használható feleslegesen a fragmentkondenzációk és ciklizációk során	Fragmentkondenzációk és ciklizációk során feleslegesen használható

Hivatkozások

1. Albericio F, Cases M, Alsina J, Triolo SA, Carpino LA, Kates SA. 1997. On the use of PyAOP, a phosphonium salt derived from HOAt, in solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 38(27):4853-4856. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(97)01011-3

2. Carpino LA. 1993. 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole. An efficient peptide coupling additive. J. Am. Chem. Soc.. 115(10):4397-4398. https://doi.org/10.1021/ja00063a082

3. Albericio F, Bofill JM, El-Faham A, Kates SA. 1998. Use of Onium Salt-Based Coupling Reagents in Peptide Synthesis1. J. Org. Chem.. 63(26):9678-9683. https://doi.org/10.1021/jo980807y

4. Marder O, Shvo Y, Albericio F. 2003. HCTU and TCTU: New Coupling Reagents ? Development and Industrial Aspects. ChemInform. 34(32): https://doi.org/10.1002/chin.200332258

5. El-Faham A, Funosas RS, Prohens R, Albericio F. 2009. COMU: A Safer and More Effective Replacement for Benzotriazole-Based Uronium Coupling Reagents. Chem. Eur. J.. 15(37):9404-9416. https://doi.org/10.1002/chem.200900615

6. Subirós-Funosas R, Nieto-Rodriguez L, Jensen KJ, Albericio F. 2013. COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents. J. Pept. Sci.. 19(7):408-414. https://doi.org/10.1002/psc.2517

7. Subirós-Funosas R, El-Faham A, Albericio F. 2010. PyOxP and PyOxB: the Oxyma-based novel family of phosphonium salts. Org. Biomol. Chem.. 8(16):3665. https://doi.org/10.1039/c003719b

8. Novabiochem Innovations 03/10.. [Internet]. Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/reagents-chemicals-and-labware/novabiochem-learning-center/novabiochem-publications/novabiochem-innovations/J2ib.qB.rDYAAAFLHaQp.xHd,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1

9. Gausepohl H, Pieles U, Frank R. 1992. Peptides: chemistry and biology. ESCOM. Leiden.523.