Aszpartimid-képződés megoldása Fmoc SPPS-ben Fmoc-Asp(OBno)-OH-val

Az aszparaginsavtartalmú szekvenciák ismételt expozíciója olyan bázisokkal, mint a piperidin, az aszparaginsav-képződést^1,2 okozza, és végül 9 különböző melléktermék (1. ábra)^3-8 keletkezéséhez vezethet. Míg sok esetben az ilyen mellékreakció során keletkező aszpartimidek és α- és β-piperidididek HPLC-vel könnyen elválaszthatók a célpeptidtől, a β-aszpartil peptideket és az epimerizált α-aszpartil peptidet szinte lehetetlen eltávolítani, mivel ezek gyakran ugyanolyan retenciós idővel rendelkeznek, mint a célpeptid. Továbbá, mivel a tömegük megegyezik a célpeptidével, e melléktermékek jelenlétét nehéz kimutatni. Az aszpartimid-képződés ezért különösen komoly szempont a peptidalapú hatóanyagok gyártása során.

Az Fmoc-Asp(OBno)-OH 1 a Novabiochem^® tudósok által kifejlesztett egyedülálló építőelem, amely egyszerű és univerzális megoldást kínál az aszpartimid-képződés^9,10 leküzdésére a standard Fmoc SPPS-ben.

1. ábra. Aszpartimid-képződés, a lehetséges melléktermékek bemutatása.

Majdnem nincs aszpartimid képződés, még Asp-Gly tartalmú szekvenciák esetén sem

Az Fmoc-Asp(OtBu)-OH és Fmoc-Asp(OMpe)-OH összehasonlító vizsgálatokban, klasszikus Skorpiótoxin II peptiddel (VKDXYI, ahol X=G, N vagy R)¹¹ ahol a gyantához kötött peptideket DMF-ben 20%-os piperidinnel kezelik 200 percig, hogy 100 x 2 perces leválasztási ciklusokat szimuláljanak, az Fmoc-Asp(OBno)-OH messze a legjobb eredményeket adta. X=N és R esetén szinte kimutathatatlan mennyiségre csökkentette az aszpartimidképződést (2. ábra, 3. ábra, 1. táblázat). A legnehezebb helyzetet jelentő X=G esetében az aszpartimid képződést mindössze 0,1%/ciklusra csökkentette, ami elhanyagolható, ha figyelembe vesszük, hogy ez a kereskedelmi forgalomban kapható N-α-Fmoc aminosavak tisztasági határán belül van (4. ábra, 1. táblázat).

Növeltebb királis stabilitás

Az aszpartimidek királisan labilisak⁷, ami az Asp(OtBu) és Asp(OMpe) felhasználásával előállított skorpiótoxin II peptideknél megfigyelt magas D-aszpartát értékekben tükröződik (1. táblázat). A D-aszpartil peptidek gyakran a tisztított peptidek rejtett szennyezői, azonos molekulatömegük és közel azonos fizikai-kémiai tulajdonságaik miatt. Az Fmoc-Asp(OBno)-OH-val kapott alacsony D-Asp értékek erősen utalnak a peptidgyártási folyamatokban való felhasználására.

Egyszerűen párosítható és nincsenek alkilezési termékek

A standard Fmoc SPPS (Gly²)-GLP-2, egy 33mer, Fmoc-Asp(OBno)-OH alkalmazásával olyan nyerset kaptunk, amely elhanyagolható aszpartimiddel kapcsolatos szennyeződéseket tartalmazott, és 25%-kal növelte a célpeptid tartalmát a standard Fmoc-Asp(OtBu)-OH származékhoz képest (5. ábra). A két Fmoc-Asp(Bno)-OH esetében egyszeri egyórás csatolást alkalmaztunk. A termék nagy tisztasága azt jelezte, hogy az Fmoc-Asp(OBno)-OH könnyen kapcsolt, és használata nem vezetett Bno alkilezési melléktermékek képződéséhez a TFA-közvetítésű hasítás során.

1. táblázat. VKDXYI peptidil-gyantákból nyert nyers termékek összetétele 20%-os DMF-ben DMF-ben, szobahőmérsékleten végzett 20%-os piperidin kezelés után. ^a A k ciklusonkénti bomlás számítása: elsőrendű bomlás: N = N₀ - e^-kt → k = -ln(N)/t ; N₀ = 1; t = ciklusok száma (100); N = a célpeptid területének %-a.

Asp(OR)-(X) R = X =	Feltételek	D-Asp	Aspartimid Per
tBu Arg	Piperidin RT-n	25	1.24
Mpe Arg	Piperidin RT-nél	11	0.4
Bno Arg	Piperidin RT-nél	1.1	0.06
tBu Asn	Piperidin RT-nél	9,1	1.65
Mpe Asn	Piperidin RT-nél	4.2	0.49
Bno Asn	Piperidin RT-nél	0.9	0.04
tBu Gly	Piperidin RT-nél	18	0.49
Mpe Gly	Piperidin RT-nél	6	0.19
Bno Gly	Piperidin RT-nél	1.4	0.14

2. ábra. A VKDNYI nyers, hasított peptidek UPLC-profiljai 20%-os piperidinnel DMF-ben 18 órán át végzett kezelés után. 1: termék; 2: D/L aszpartimidek; 3: D/L piperididek. A: Fmoc-Asp(OtBu)-OH-val készült; B: Fmoc-Asp(OMpe)-OH-val készült; C: Fmoc-Asp(OBno)-OH-val készült.

3. ábra. A VKDRYI nyers, hasított peptidek UPLC-profiljai 20%-os piperidinnel DMF-ben 18 órán át végzett kezelés után. 1: termék; 2: D/L aszpartimidek; 3: D/L piperididek. A: Fmoc-Asp(OtBu)-OH-val készült; B: Fmoc-Asp(OMpe)-OH-val készült; C: Fmoc-Asp(OBno)-OH-val készült.

4. ábra. A VKDGYI nyers, hasított peptidek UPLC-profiljai 20%-os piperidinnel DMF-ben 18 órán át végzett kezelés után. 1: termék; 2: D/L aszpartimidek; 3: D/L piperididek. A: Fmoc-Asp(OtBu)-OH-val készült; B: Fmoc-Asp(OMpe)-OH-val készült; C: Fmoc-Asp(OBno)-OH-val készült.

5. ábra. Az A, Fmoc-Asp(OtBu)-OH és B, Fmoc-Asp(OBno)-OH felhasználásával készült nyers hasított Gly-GLP-2 UPLC-profiljai. A: D/L-aszpartimidek; B: D/L-α/β-piperidididek.

Hivatkozások

1. Barany G, Merrifield RB. in The peptides, Vol. 2, E. Gross & J. Meienhofer (Eds), Academic Press, New York, 1979, pp. .1-234..

2. Bodansky M, Martinez J. (1978). in The peptides, Vol. 5, E. Gross & J. Meienhofer (Eds), Academic Press, New York, 1983, pp. 111-216..

3. Nicolás E, Pedroso E, Girald E. 1989. Formation of aspartimide peptides in Asp-Gly sequences. Tetrahedron Letters. 30(4):497-500. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)95238-9

4. Dölling R. et al. (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 853.

5. Yang Y, Sweeney WV, Schneider K, Thörnqvist S, Chait BT, Tam JP. 1994. Aspartimide formation in base-driven 9-fluorenylmethoxycarbonyl chemistry. Tetrahedron Letters. 35(52):9689-9692. https://doi.org/10.1016/0040-4039(94)88360-2

6. Lauer JL, Fields CG, Fields GB. 1995. Sequence dependence of aspartimide formation during 9-fluorenylmethoxycarbonyl solid-phase peptide synthesis. Lett Pept Sci. 1(4):197-205. https://doi.org/10.1007/bf00117955

7. I. Schön, et al. (1991) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 3213..

8. Orpiszewski J, Schormann N, Kluve-Beckerman B, Liepnieks JJ, Benson MD. 2000. Protein aging hypothesis of Alzheimer disease. FASEB j.. 14(9):1255-1263. https://doi.org/10.1096/fasebj.14.9.1255

9. Behrendt R, Huber S, Martí R, White P. 2015. New t-butyl based aspartate protecting groups preventing aspartimide formation in Fmoc SPPS. J. Pept. Sci.. 21(8):680-687. https://doi.org/10.1002/psc.2790

10. Behrendt R, Huber S, White P. 2016. Preventing aspartimide formation in Fmoc SPPS of Asp-Gly containing peptides - practical aspects of new trialkylcarbinol based protecting groups. J. Pept. Sci.. 22(2):92-97. https://doi.org/10.1002/psc.2844

11. Mergler M, Dick F, Sax B, Weiler P, Vorherr T. 2003. The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS. Part I. J. Peptide Sci.. 9(1):36-46. https://doi.org/10.1002/psc.430