Szintetikus peptid kezelési és tárolási protokoll

A szintetikus peptidekkel való munka egyik legnagyobb kihívása a legjobb oldószer meghatározása, amelyben a peptid feloldható. A szintetikus peptid megfelelő tárolására, kezelésére és feloldására vonatkozó általános irányelvek az alábbiakban találhatók.

Liofilizált peptidek tárolása

A liofilizált peptideket szobahőmérsékleten szállítják, és napokig vagy hetekig stabilak maradnak. Hosszú távú tárolás esetén az anyagot -20 °C-on vagy hidegebb hőmérsékleten és erős fénytől védve kell tárolni.

A nedvességnek való kitettség csökkenti a liofilizált peptidek hosszú távú stabilitását. A peptid felhasználása előtt vegyük ki a hűtőtárolásból, és hagyjuk, hogy a peptid szobahőmérsékletre kiegyenlítődjön, mielőtt eltávolítjuk a tartály fedelét. Ez csökkenti a környező légkörben lévő nedvesség felvételét.

Peptidek oldása

Nincs univerzális oldószer az összes liofilizált peptid szolubilizálására, miközben a biológiai vizsgálatokban is megőrzi integritásukat és kompatibilitásukat. A legjobb oldószer kiválasztása egy "próba és tévedés" folyamat eredménye lehet. Adott esetben célszerű először olyan oldószereket kipróbálni, amelyek viszonylag könnyen eltávolíthatók liofilizálással, arra az esetre, ha a kezdeti oldószer nem oldja fel a peptidet. A teljes peptidminta feloldása előtt mindig tesztelje a peptid egy részét. Az alábbi lépések általános útmutatót nyújtanak a peptidek szolubilizációjához. Bármely alkalmazott oldószer esetében figyelembe kell venni az oldószer toleranciáját az Ön vizsgálatában, mielőtt megkísérli ezeket a stratégiákat.

Az oldhatósági jellemzők meghatározása

A peptid aminosav-összetételének értékelése előzetes eszköz a peptid oldhatósági jellemzőinek megértéséhez. A peptidben lévő ionos töltések száma és típusa határozza meg az oldhatóságot vizes oldatokban. Általában minél több töltött maradékkal rendelkezik a peptid, annál jobban oldódik vizes oldatokban. Kérjük, vegye figyelembe, hogy mivel a peptidek általában több töltéssel rendelkeznek a pH 6-8, mint a pH 2-6 értékeknél, valószínűbb, hogy jobban oldódnak a közel semleges pH értéken. Kivételt képeznek az olyan peptidszekvenciák, amelyek nagyon hidrofóbok és hajlamosak az aggregációra. Bár a szekvencia hidrofób volta lehet az aggregáció elsődleges oka, a peptidek a kiterjedt hidrogénkötés révén is aggregálódnak vagy "gélképződnek".

A következő irányelvek alapján határozzuk meg, hogy a peptid bázikus, savas vagy semleges-e:
1. lépés. Minden savas maradékhoz (D, E és C-terminális COOH) rendeljünk -1 értéket.
2. lépés. Adjunk +1 értéket minden bázikus maradékhoz (K, R és az N-terminális NH2).
3. lépés. Minden H-maradékhoz rendeljünk +1 értéket pH <6 esetén vagy nullát pH >6 esetén.
4. lépés. Adjuk össze a peptid összes töltését pH 7-nél (az összes D, E, K, R, C-terminális COOH és N-terminális NH2), hogy kiszámítsuk a peptid teljes nettó töltését.

A töltött peptidek oldhatósági megközelítése

A fenti irányelvek alapján határozza meg a peptid teljes oldhatósági típusát a következő stratégiák segítségével:

Savas peptidek (a nettó töltés negatív)

A peptid akkor tekinthető savasnak, ha a peptid teljes nettó töltése negatív. Ha a peptid savas, és/vagy ha a peptid összes töltése pH 7-nél nagyobb, mint a maradékok teljes számának 25%-a, adjunk hozzá kis mennyiségű 0,1 M ammónium-hidrogénkarbonátot a peptid feloldásához, és hígítsuk vízzel a kívánt koncentrációra. Győződjön meg arról, hogy a peptidoldat eredő pH-ja megközelítőleg 7, és szükség szerint állítsa be a pH-t.

Bázikus peptidek (a nettó töltés pozitív)

A peptid akkor tekinthető bázikusnak, ha a peptid teljes nettó töltése pozitív. Ha a peptid bázikus, és a peptid összes töltése pH 7-nél a teljes maradékszám 10 és 25%-a között van, adjunk hozzá kis mennyiségű 25%-os ecetsavat a peptid feloldásához, és hígítsuk vízzel a kívánt koncentrációra.

Semleges peptidek (a nettó töltés nulla)

A peptid akkor tekinthető semlegesnek, ha a peptid összes nettó töltése nulla. Ha a teljes töltések száma meghaladja a maradékok teljes számának 25%-át, akkor a savas peptideknél leírt stratégiát kell alkalmazni.

Egyéb megfontolások

Ha a peptid teljes töltésszáma a maradékok teljes számának kevesebb mint 10%-a, akkor szerves oldószerek használata ajánlott.

Az erősebb oldószerek kipróbálása előtt szonikázza a peptidoldatot, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a peptid nem oldódik a választott oldószerben. A szonikálás fokozza az oldódást, a szilárd peptidet kisebb részecskékre bontja. Ha a szonikálás után az oldat zselésedett, zavarosnak tűnik, vagy látható részecskéket tartalmaz, a peptid nem oldódott fel teljesen, hanem szuszpendált. Ekkor erősebb oldószerre van szükség. Ha a peptid nem oldódik fel, liofilizálja és távolítsa el az illékony pufferoldatot. Ha a minta megszáradt, alternatív oldószereket lehet tesztelni ugyanazon a mintán.

Hidrofób/töltés nélküli peptidek oldási megközelítése

Az 50%-nál több hidrofób maradékot tartalmazó peptidszekvenciák, a 25%-nál kevesebb töltött aminosavat tartalmazó semleges peptidek és/vagy a 10%-nál kevesebb töltött aminosavat tartalmazó peptidek esetében szerves oldószerek használata ajánlott. Az acetonitril (ACN), dimetilszulfoxid (DMSO) vagy dimetil-formamid (DMF) javasolt oldószerek. Az olyan kaotróp vegyületek, mint a guanidin-hidroklorid vagy a karbamid hozzáadása elősegítheti a hidrofób kölcsönhatások felbontását, vagy a hidrogénkötés-hálózat megbontásával csökkentheti a peptidek "zselésedését". A kiválasztási folyamat során figyelembe kell venni, hogy a vizsgálat mennyire tolerálja ezeket a szerves vagy kaotróp reagenseket. A Cys (C) és Met (M) tartalmú peptidszekvenciák instabilak DMSO-ban. Fontos, hogy a peptidet teljesen feloldjuk a kiindulási oldószerben (például ecetsav, acetonitril, DMSO vagy DMF), mivel a peptidek oldódási sebessége ezekben az oldószerekben általában nagyobb, mint víz/oldószer keverékben. Ha a víz/oldószer keveréket használjuk először a peptid feloldásához, akkor előfordulhat, hogy a szükségesnél sokkal nagyobb mennyiségű nem vizes oldószert adunk a peptidmintához. A peptid teljes feloldódásának elősegítéséhez szonikációra is szükség lehet.

Azt követően, hogy a peptid feloldódott a kezdeti oldószerben, különösen a szerves oldószerekben oldott peptidek esetében, hígítsa a peptidet úgy, hogy a pufferoldatba lassan (cseppenként) adagolja a peptidoldatot, gyengéd, de folyamatos keverés mellett. Ez a technika megakadályozza a peptid lokális koncentrációját a vizes oldatban, ami potenciálisan a peptid kicsapódását eredményezheti. Ennek a stratégiának az az előnye, hogy a peptid kicsapódása vizuálisan nyomon követhető, és ennek megfelelően lehet cselekedni.

Munka törzsoldat készítése

Készítsen peptid törzsoldatot a kísérleti vizsgálathoz szükségesnél nagyobb koncentrációban a peptid steril desztillált vízben vagy adott esetben steril hígított ecetsavban (0,1%) történő feloldásával. A peptid törzsoldat tovább hígítható a vizsgálati pufferrel.

Vigyázat! Ha a peptid feloldásához kezdetben a nem illékony sótól és/vagy szerves oldószertől mentes assay puffert használjuk, és az nem oldódik fel, a peptid kinyerése kihívást jelenthet. Ha a peptid nem oldódik vízben vagy ecetsavban, a peptidoldat liofilizálható vissza eredeti állapotába. Miután a peptid liofilizálódott, alternatív oldószerekkel lehet próbálkozni.