Pull-down vizsgálatok

A pull-down vizsgálatok során a fehérjekomplexet gyöngyökre történő adszorbeálással izolálják. A gyöngyökön immobilizált ligandumok specifikusan kötődnek a komplex valamelyik komponenséhez, akár egy affinity tag (pl. GST, hisztidin, maltózkötő fehérje stb.), akár egy antitest segítségével. A pull-down próbákat gyakran használják kis µg mennyiségű komplexek izolálására, főként az egyes alegységek azonosítása céljából. Korlátozott funkcionális vizsgálatokhoz szükséges anyag izolálására is használták őket, de nagyobb (mg) mennyiségek előállítására más módszerek alkalmasabbnak tűnnek. A befogott komplex komponenseit végül gyakran tömegspektrometriával elemzik az alegységek azonosítása céljából.

A pull-down próbák fontos eszközei a fehérje-fehérje kölcsönhatási hálózatok feltérképezésének. Globális szinten sikeresen alkalmazták őket a fehérje-fehérje kölcsönhatások feltérképezésére számos szervezetben (pl. élesztő, E. coli, C. elegans). Az élesztő-kettő-hibrid (Y2H) rendszert és hasonló technológiákat alkalmazó genetikai megközelítések hasznos kiegészítői a multifehérje-komplexek izolálásának. A fehérje-fehérje kölcsönhatások globális szintű feltérképezésével kapcsolatban a hamis pozitív eredmények jelentik a legnagyobb gondot. Ezért a vonatkozó kontrollkísérletek mellett hasznos mind a komplexizolációs, mind az Y2H-kísérleteket egymástól függetlenül elvégezni az adatsorok validálása érdekében. Ezt követheti a verifikáció in vivo-jellegűbb környezetben.

Ez a szakasz három különböző pull-down módszerrel foglalkozik, amelyekkel kis mennyiségű komplexek izolálhatók a komplex komponenseinek azonosítása céljából. A módszerek közül kettő a komplex egy (ismert vagy feltételezett) komponensének affinitásjelölését foglalja magában. A harmadik módszer, a koimmunoprecipitáció, egy (ismert vagy feltételezett) komponens ellen irányuló antitest használatát jelenti. Mindhárom módszer megfelelő ligandumokkal ellátott gyöngyöket használ a komplexnek a nyers biológiai mintából történő lehúzására. A különböző módszerek előnyeinek és hátrányainak áttekintése a 2.1. táblázatban látható.

2.1. táblázat A fehérjekomplexek visszanyerésére szolgáló különböző pull-down próbák előnyei és hátrányai

Módszer	Elônyök
Affinitás lehúzása	Generikus Képesség alacsonyabundáns fehérjekomplexek tisztítására	A fehérje tag jelenléte influence eredmények Verseny az endogén komplexszel
Tandem affinity purification (TAP)	Generikus Képesség alacsonyabundáns fehérjekomplexek tisztítására A végig alkalmazott enyhe körülmények	A fehérjetag jelenléte befolyásolhatja az eredményeket Verseny az endogén komplexszel
Co-immunoprecipitáció	Nem igényel klónozást és heterológ expressziót. Gyors, ha rendelkezésre áll antitest	Nem általános - speciális antitestekhez való hozzáférés szükséges

Affinity pull-down assay

Affinity pull-down assay-k jól beváltak a fehérjekomplexek izolálására és későbbi azonosítására. A GST pull-down vizsgálatok során egy vagy több ismeretlen fehérjét tisztítanak meg egy biológiai mintából egy GST-jelölésű csalifehérje segítségével. Az alapelv az, hogy a GST-címkézett csalifehérje kötődik partnereihez, és a keletkező komplexet immobilizált glutationnal ellátott gyöngyökön rögzítik. A csalifehérje hiányában a GST-hez kötődő hamis pozitivitások azonosítására kontrollt is tartalmaznak. A kontroll lehet külön transzformált sejtekből származó lizátum, amelyek GST-t expresszálnak (nem a csalifúziós fehérjét), vagy nem transzformált sejtekből származó lizátum, amelyhez GST-t adtunk. A kísérlethez megfelelő kontrollok megtervezése alapvető fontosságú.

Egy gyakori vizsgálati forma a gyöngyök és a megkötött fehérjék centrifugával történő lepergetése, innen a "pull-down" kifejezés. Az elvet a 2.4. ábra mutatja be.

2.4. ábra. Egy GST pull-down kísérlet vázlata. A jobb oldali eljárás a kontrollkísérletet mutatja. Ebben a példában két fehérjét (lila és piros) azonosítottunk SDS-PAGE segítségével, mint a csalifehérje (bal oldali sáv) kölcsönhatási partnereit. Egy további fehérjét (zöld) lehúztunk, de azt a kontroll hamis pozitívként (GST-kötő) azonosította (jobb oldali sáv).

GST pull-down assay GST SpinTrap Purifikációs modul használatával

Anyagok

GST SpinTrap Purifikációs modulkation Module, amely 10× PBS-t, MicroSpin oszlopokat, hígítási puffert és redukált glutationt tartalmaz

Puffer előkészítés

1× PBS: Az 1× PBS elkészítéséhez hígítsa tízszeresére a mellékelt 10× PBS-t steril vízzel. Tárolja 4 °C-on. A végső koncentráció 10 mM foszfát, 2,7 mM KCl, 140 mM NaCl, pH 7,3.

Hígító puffer:  a mellékeltnek megfelelően, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0

Hígító puffer:   10 mM redukált glutation, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Az elúciós puffer elkészítéséhez öntsük a modulhoz mellékelt 50 ml hígítópuffer teljes térfogatát a redukált glutationt (0,154 g) tartalmazó üvegbe. Rázzuk, amíg teljesen fel nem oldódik. Tárolja 1-20 ml-es aliquotokban -20 °C-on.

Eljárás

A fehérjekomplex komponensek kimutatásához szükséges lizátum mennyisége változó. Hasznos kiindulási pont a 106-107 szövettenyésztési sejtnek megfelelő lizátum térfogat. Használjon egy második oszlopot egy kontrollkísérlet elvégzéséhez, amelyben csak GST-t tartalmazó sejtlízist használ (csalifúziós fehérje nélkül).

1. Óvatos vortexeléssel reszuszpendálja a Glutathione Sepharose 4B-t minden egyes SpinTrap oszlopban.
2. Lazítsa meg az oszlop kupakjait egynegyed fordulatra. Távolítsa el (és mentse el) az alsó záróelemeket.
3. Tegyen minden oszlopot egy tiszta 1,5 vagy 2 mL-es mikrocentrifugacsőbe. Centrifugáljon 735 × g-n 1 percig.
4. Dobja ki a puffert minden egyes centrifugacsőből, és helyezze vissza az alsó záróelemeket.
5. Alkalmazzon legfeljebb 600 µL GST-fúziós (csalifehérjét) tartalmazó lizátumot egy oszlopra. Kontrollként alkalmazzon ugyanekkora mennyiségű GST-fúziós (csalifehérje nélküli) lizátumot.
6. Töltsön vissza minden oszlopot biztonságosan, és óvatos, ismételt inverzióval keverje össze. Inkubáljuk 4 °C-on 2 órán át.
7. Vegyük le (és őrizzük meg) a felső kupakokat és az alsó lezárásokat. Helyezzen minden oszlopot egy tiszta, előre  címkével ellátott 1,5 vagy 2 ml-es mikrocentrifugacsőbe.
8. Centrifugáljon 735 × g-n 1 percig a flowthrough összegyűjtéséhez. Mentsük meg a flowthrough-t az SDS-PAGE analízishez.
9. Tegyük az oszlopokat egy tiszta, előre megjelölt 1,5 vagy 2 mL-es mikrocentrifugacsőbe.
10. Adjunk 600 µl 1× PBS mosópuffert minden oszlophoz, és ismételjük meg a centrifugálási eljárást. Kívánság szerint további 600 µl mosás végezhető 1× PBS-szel. A jó eredmények érdekében fontos, hogy ezt a lépést optimalizáljuk.
11. Adjunk 100-200 µl elúciós puffert minden oszlophoz. Helyezze vissza a felső kupakokat és az alsó záróelemeket. Inkubálja szobahőmérsékleten 5-10 percig. Fontos, hogy ezt a lépést optimalizálja a jó eredmények érdekében.
12. Vegye le és dobja el a felső kupakokat és az alsó lezárásokat, és helyezze az egyes oszlopokat egy tiszta 1,5 vagy 2 ml-es mikrocentrifugacsőbe.
13. Centrifugálja az összes oszlopot, és gyűjtse össze az eluátumokat. Elemezze SDS-PAGE segítségével.

A pufferfeltételek megválasztása befolyásolhatja a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat.

A mosási feltételeket minden kísérlethez optimalizálni kell.

A komplex gyenge visszanyerésének oka lehet, hogy az affinity tag nem hozzáférhető az affinity ligandumhoz való kötődéshez, amikor a komplex már kialakult. Ilyen esetekben ajánlott a címkézési hely megváltoztatása (pl, N-terminálisról C-terminálisra) vagy egy másik komplexkomponenst jelölni.

A léptéktől és a kívánt áteresztőképességtől függően számos lehetőség áll rendelkezésre a GST pull-down próbákhoz (lásd az "Anyagok" című részt e szakasz alján).

Tandem affinity purification, TAP

A TAP-módszert, módosításokkal vagy anélkül, élesztőből, trypanoszómákból, gyümölcs fliliákból, emberből és növényekből származó komplexek tisztítására és azonosítására használták.

A TAP abban különbözik a korábban leírt megközelítéstől, hogy a fehérjekomplexek izolálásához két egymást követő affinitáskromatográfiás lépést alkalmaz. A két affinitási lépés alkalmazása mögött az áll, hogy fokozza a tisztítási eljárás specifikusságát, és ezáltal csökkentse a hamis pozitív eredmények számát. Továbbá, a módszer során alkalmazott körülmények enyheek a komplex integritásának megőrzése és a hozam maximalizálása érdekében. A módszert már számos esetben sikeresen alkalmazták.

A TAP alapelvét a 2.5. ábra mutatja be. Briefly, egy csalifehérjét (egy ismert vagy feltételezett komplexkomponenst) mind A fehérjével, mind kalmodulin-kötő peptiddel (CBP) jelölünk, a két címke között pedig egy dohánymartavírus (TEV) proteáz hasítóhelyet helyezünk el. A kettős jelölésű csalifehérjét közel természetes szinten expresszáljuk, mivel a túlterjedés nem fiziológiás kölcsönhatásokat válthat ki. A komplexet first az IgG Sepharose gyöngyökre adszorbeáljuk az A fehérje címkén keresztül, majd TEV-vel történő hasítással eluáljuk. A komplexet ezután kalmodulin szefaróz gyöngyökre adszorbeáljuk (a CBP tag-en keresztül) és EGTA-val eluáljuk. A komplex komponenseket SDS-PAGE segítségével elválasztjuk és tömegspektrometriával elemezzük.

2.5. ábra. A tandem affinity purification (TAP) módszer áttekintése. A TAP-tag CBP-t (kalmodulin-kötő peptid) tartalmaz, amely egy TEV hasítóhellyel elválasztott Protein A doménhez kapcsolódik. A figyelem újranyomtatására az Elsevier Globális Jogok Osztálya adott engedélyt.

Felsőbbrendű szervezetekben szükség lehet a célfehérje megfelelő endogén génjének elnyomására az RNAi technológia (iTAP) alkalmazásával.

Co-immunoprecipitáció

Az immunoprecipitáció egy jól bevált technika, amely antitesteket használ antigének izolálására nyers biológiai mintákból. Az elnevezés történelmi eredetű, és az antitest és antigén megfelelő arányú keverésekor kapott kicsapási reakción alapuló analitikai módszerekből származik. Az itt leírt módszer nem kicsapási reakció, hanem pull-down vizsgálat. A ko-immunprecipitáció egy komplex egy (ismert vagy feltételezett) összetevője ellen irányuló antitesteket használ. Az antitest kötődik az antigénjéhez, amely egy többfehérje-komplex része. Az antitest-fehérje komplex összeállítását ezután a keverékhez hozzáadott   protein A vagy protein G szefaróz gyöngyökkel rögzítjük. Az elvet a 2.6. ábra mutatja be.

Alternatívaként a megfelelő antitest immobilizálható egy aktivált mátrixon, például NHS-aktivált szefarózon. Hasonlóképpen, egy antitestet keresztkötéssel lehet fehérje A vagy fehérje G közeghez kötni, és fehérjekomplexek komponenseinek koimmunoprecipitálására használni.

2.6. ábra. Egy koimmunoprecipitációs kísérlet vázlata.

Co-immunoprecipitáció A vagy G fehérjével

Anyagok Immunoprecipitációs Starter Pack (tartalmazza a nProtein A Sepharose 4 Fast Flow és a Protein G Sepharose 4 Fast Flow csomagot)

Lízispufferek

2.3. táblázat Emlős szövettenyésztési sejtek gyakori lízispufferei

Név	Megnevezés	Megnevezés	Szigorúság
Kis só	1% Igepal™ CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	+
Nonidet™ P-40	150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	++
RIPA	150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% nátrium dezoxikolát (DOC), 0,1% SDS, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	+++
Nagy sótartalmú	500 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.	++++

Más pufferek

PBS: 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4

Mosópuffer: 50 mM Tris, pH 8

Mintapuffer: (redukáló)
 

Média előkészítése

nA fehérje A Sepharose 4 Fast Flow és a fehérje G Sepharose 4 Fast Flow előbugyasztva, 20%-os etanolban kerül forgalomba. Használat előtt mindegyik hordozót alaposan át kell mosni, hogy a 20%-os etanolos tárolóoldatot eltávolítsuk. A maradék etanol zavarhatja a későbbi eljárásokat.

Mintánként 50 µl nProtein A Sepharose 4 Fast Flow vagy Protein G Sepharose 4 Fast Flow 50%-os szuszpenzióra lesz szüksége. Győződjön meg róla, hogy a gyöngyök megfelelően szuszpendáltak az átvitel előtt.

1. Óvatosan rázza fel az nProtein A Sepharose 4 Fast Flow vagy Protein G Sepharose 4 Fast Flow palackot a közeg reszuszpendálásához.
2. A szélesfuratú hegyű pipettával távolítsa el a suffitikus iszapot, és vigye át az iszapot egy megfelelő tartályba/csőbe. Ha szükséges, vágja le a pipetta hegyét, hogy nagyobb nyílást hozzon létre.
3. Szedimentálja a tápfolyadékot 12 000 × g-n 20 másodpercig tartó centrifugálással. Óvatosan dekantálja a felülúszót.
4. Mossa át a tápfolyadékot 10 térfogatnyi lízispuffer (lásd alább) hozzáadásával. Invertáljuk a keveréshez.
5. Szedimentáljuk a táptalajt 12 000 × g-nél 20 másodpercig tartó centrifugálással. Dekantáljuk a felülúszót.
6. Ismételjük meg a 4. és 5. lépést összesen három mosás erejéig.

A 2. lépésben adagolt eredeti tápfolyadék-iszap minden egyes ml-éhez adjunk 0,5 ml lízispuffert. Ez 50%-os szuszpenziót eredményez. Tárolja 4 ºC-on, és használat előtt jól keverje össze.

Az antigén megkötése

1. A mintákat (500 µl) új mikrocentrifugacsövekbe adagolja.
2. Adjon hozzá poliklonális szérumot (0.5-5 µL), hibridóma szövettenyésztési felülúszót (5-100 µL), aszcitisz fluidot (0,1-1 µL), vagy tisztított monoklonális vagy poliklonális antitesteket (adjunk hozzá 1-5 µg-nak megfelelő térfogatot). A kontrollokhoz olyan nem-immun antitesteket használjunk, amelyek a lehető legközelebb állnak a specifikus antitesthez (például a poliklonális szérumot azonos fajból származó normál szérummal kell összehasonlítani).
3. Kíméletesen keverjük 1 órán át 4 ºC-on.

Immunkomplexek kicsapása

1. Adjunk hozzá 50 µl nProtein A Sepharose 4 Fast Flow vagy Protein G Sepharose 4 Fast Flow szuszpenziót (50%-os szuszpenzió).
2. Óvatosan keverjük 1 órán át 4 ºC-on.
3. Centrifugáljuk 12 000 × g-n 20 s-ig, és mentsük el a pelletet (a gyöngyöket).
4. Mossuk a pelletet háromszor 1 mL lízispufferrel és egyszer mosópufferrel. Centrifugáljon 12 000 × g-n 20 s-ig minden mosás között, és óvatosan távolítsa el a felülúszókat.

Diszszociáció és elemzés

1. Suszpendálja a final pelletet 30 µl mintapufferben.
2. Fűtsük 95 ºC-ra és inkubáljuk 3 percig.
3. Centrifugáljuk 12 000 × g-n 20 s-ig a gyöngyök eltávolításához. A felülúszót óvatosan vigye át egy tiszta csőbe.
4. Adjon 1 µl 0,1%-os brómfenol-kéket a felülúszóhoz.
5. A felülúszót SDS-PAGE segítségével elemezze, majd fehérjefestést, tripszin emésztést és tömegspektrometriás elemzést végezzen.