Liposzóma készítmény - Avanti^® poláris lipidek

Dr. Stephen Burgess

Chief Scientific Officer at Avanti® Polar Lipids

1. A vezikulák képződésének mechanizmusa

A liposzómák (lipidvezikulák) akkor keletkeznek, amikor vékony lipidfilmek vagy lipidpogácsák hidratálódnak, és a folyadékkristályos kettősrétegek halmazai folyékonnyá válnak és megduzzadnak. A hidratált lipidlapok a keverés során leválnak és önzáródnak, hogy nagy, multilamellás vezikulákat (LMV) alkossanak, ami megakadályozza a víz kölcsönhatását a kétréteg szénhidrogén magjával a széleken. Miután ezek a részecskék kialakultak, a részecskék méretének csökkentése energiabevitelt igényel szonikus energia (szonikáció) vagy mechanikai energia (extrudálás) formájában.

A kép Lasic, D.D., Recherche 20, 904, 1989, alapján készült.

2. A liposzóma előállításának módszere

A lipidkészítmények tulajdonságai az összetételtől függően változhatnak (kationos, anionos, semleges lipidfajok), azonban az összetételtől függetlenül minden lipidvezikulára ugyanaz az előállítási módszer alkalmazható. Az eljárás általános elemei közé tartozik a lipid előkészítése a hidratáláshoz, a hidratálás keveréssel és a méretezés a vezikulák homogén eloszlásának eléréséhez.

A. A lipid előkészítése a hidratáláshoz

A vegyes lipid-összetételű liposzómák előállítása során a lipideket először fel kell oldani és szerves oldószerben össze kell keverni, hogy biztosítsuk a lipidek homogén keverékét. Általában ezt a folyamatot kloroform vagy kloroform:metanol keverékkel végzik. A cél az, hogy tiszta lipidoldatot kapjunk a lipidek teljes összekeveréséhez. A lipidoldatokat általában 10-20 mg lipid/ml szerves oldószerrel állítják elő, bár magasabb koncentrációk is használhatók, ha a lipidek oldhatósága és keveredése elfogadható. Miután a lipidek alaposan elkeveredtek a szerves oldószerben, az oldószert eltávolítjuk, hogy lipidfilmet kapjunk. Kis mennyiségű szerves oldószer (<1mL) esetén az oldószer elpárologtatható száraz nitrogén- vagy argonárammal egy füstelvezetőben. Nagyobb térfogatok esetén a szerves oldószert rotációs párologtatással kell eltávolítani, így egy vékony lipidfilm keletkezik a kerekfenekű lombik oldalán. A lipidfilmet alaposan meg kell szárítani a maradék szerves oldószer eltávolítása érdekében, ha az injekciós üveget vagy lombikot egy éjszakára vákuumszivattyúra helyezzük. Ha a kloroform használata kifogásolható, alternatívaként a lipid(ek) tercier butanolban vagy ciklohexánban oldható(k) fel. A lipidoldatot tartályokba töltjük, és a tartályokat szárazjégre helyezve vagy szárazjég-aceton vagy alkohol (etanol vagy metanol) fürdőben forgatva fagyasztjuk. A fürdőeljárás alkalmazásakor ügyelni kell arra, hogy a tartály repedés nélkül kibírja a hirtelen hőmérsékletváltozásokat. A teljes fagyasztás után a fagyasztott lipidpogácsát vákuumszivattyúra helyezzük és liofilizáljuk, amíg megszárad (1-3 nap a mennyiségtől függően). A lipidpogácsa vastagsága nem lehet nagyobb, mint a liofilizáláshoz használt tartály átmérője.A száraz lipidfilmeket vagy -pogácsákat le lehet venni a vákuumszivattyúról, a tartályt szorosan lezárni és leragasztani, majd fagyasztva tárolni a hidratálásig.

B. A lipidfilm/torta hidratálása

A száraz lipidfilm/torta hidratálása egyszerűen úgy történik, hogy a száraz lipidtartályba vizes közeget adunk és keverjük. A hidratáló közeg hőmérsékletének a száraz lipidhez való hozzáadás előtt a legmagasabb Tc-vel rendelkező lipid gél-folyadék kristályátmeneti hőmérséklete (Tc vagy Tm) felett kell lennie. A hidratáló közeg hozzáadása után a lipidszuszpenziót a hidratálás időtartama alatt a Tc felett kell tartani. Magas átmenetű lipidek esetében ez könnyen megvalósítható a lipidszuszpenzió kerekfenekű lombikba történő átvitelével és a lombikot vákuum nélküli rotációs párologtató rendszerre helyezésével. A kerekfenekű lombik forgatása a lipidszuszpenzió Tc-je feletti hőmérsékleten tartott meleg vízfürdőben lehetővé teszi a lipid hidratálását a folyékony fázisban, megfelelő keverés mellett. A hidratálási idő lipidfajonként és szerkezetenként kissé eltérő lehet, azonban erősen ajánlott 1 óra hidratálási idő erőteljes rázással, keveréssel vagy keveréssel. Úgy gondoljuk továbbá, hogy ha a hólyagszuszpenziót a méretcsökkentés előtt egy éjszakán át állni hagyjuk (öregítés), az megkönnyíti a méretezési folyamatot és javítja a méreteloszlás homogenitását. Az öregítés nem ajánlott a magas átmenetű lipidek esetében, mivel a lipidek hidrolízise a megemelkedett hőmérsékleten fokozódik.

A hidratálási közeget általában a lipidhólyagok alkalmazása határozza meg. A megfelelő hidratálási közegek közé tartozik a desztillált víz, a pufferoldatok, a sóoldat és a nem elektrolitok, például a cukoroldatok. Az in vivo alkalmazásokhoz fiziológiás ozmolalitás (290 mOsm/kg) ajánlott. Általánosan elfogadott oldatok, amelyek megfelelnek ezeknek a feltételeknek, a 0,9%-os sóoldat, az 5%-os dextróz és a 10%-os szacharóz. Hidratáció során egyes lipidek a szerkezetükre jellemző komplexeket képeznek. Megfigyelték, hogy a nagy töltésű lipidek viszkózus gélt képeznek, amikor alacsony ionerősségű oldatokkal hidratálják őket. Miniatűr A probléma enyhíthető só hozzáadásával vagy a lipidszuszpenzió kicsinyítésével. A rosszul hidratálódó lipidek, mint például a foszfatidil-etanolamin, hajlamosak a hidratálás során önaggregálódni. A 60 mol%-nál több foszfatidil-etanolamint tartalmazó lipidvezikulák olyan részecskéket képeznek, amelyek körül egy kis hidratációs réteg veszi körül a vezikulát. Ahogy a részecskék közelednek egymáshoz, nincs hidratációs taszítás, amely taszítaná a közeledő részecskét, és a két membrán egy energiakútba esik, ahol megtapadnak és aggregátumokat képeznek. Az aggregátumok nagyméretű flokulátumokként ülepednek ki az oldatból, amelyek keverés hatására szétoszlanak, de ültetéskor újraképződnek. A hidratáció terméke egy nagy, multilamelláris vezikulum (LMV), amely szerkezetében a hagymához hasonló, és minden egyes lipid kettősréteget egy-egy vízréteg választ el. A lipidrétegek közötti távolságot az összetétel határozza meg, a polihidratáló rétegek közelebb vannak egymáshoz, mint a magas töltésű rétegek, amelyek az elektrosztatikus taszítás alapján válnak el egymástól. Miután stabil, hidratált LMV szuszpenziót állítottunk elő, a részecskék különböző technikákkal, többek között szonikálással vagy extrudálással kicsinyíthetők.

C. A lipidszuszpenzió méretezése

i. Szonikáció

A LMV szuszpenziók szonikus energiával történő felbontása (szonikáció) jellemzően kisméretű, 15-50 nm közötti átmérőjű unilamelláris vezikulákat (SUV) eredményez. A szonikált részecskék előállítására szolgáló leggyakoribb műszerek a fürdő- és a szondacsúcs-szonikátorok. A csészekürtös szonikátorok, bár kevésbé elterjedtek, sikeresen állítottak elő SUV-t. A szondacsúcsos szonikátorok nagy energiát juttatnak a lipidszuszpenzióba, de a lipidszuszpenzió túlmelegedése degradációt okoz. A szonikációs csúcsok hajlamosak titánrészecskéket is kibocsátani a lipidszuszpenzióba, amelyeket felhasználás előtt centrifugálással kell eltávolítani. Ezen okok miatt a fürdőszonikátorok a legszélesebb körben használt műszerek az SUV előállításához. Az LMV-diszperzió szonikálása úgy történik, hogy a szuszpenziót tartalmazó kémcsövet egy fürdőszonikátorba helyezzük (vagy a szonikátor csúcsát a kémcsőbe helyezzük), és 5-10 percig a lipid Tc-je fölött szonikáljuk. A lipidszuszpenziónak tisztulnia kell, hogy kissé zavaros, átlátszó oldatot kapjon. A homályosság a szuszpenzióban maradt nagy részecskék okozta fényszórásnak köszönhető. Ezeket a részecskéket centrifugálással el lehet távolítani, hogy tiszta SUV-szuszpenziót kapjunk. Az átlagos méretet és eloszlást befolyásolja az összetétel és a koncentráció, a hőmérséklet, a szonikációs idő és teljesítmény, a térfogat és a szonikátor beállítása. Mivel a szonikálás körülményeit szinte lehetetlen reprodukálni, nem ritka a méretbeli eltérés a különböző időpontokban előállított tételek között. Továbbá, e membránok nagyfokú görbülete miatt a SUV-ok eredendően instabilak, és spontán összeolvadnak nagyobb vezikulákká, ha a fázisátalakulási hőmérsékletük alatt tárolják őket.

A szonikációval kapcsolatos további információkért, olvassa el a "Morrissey Lab Protocol for Preparing Phospholipid Vesicles (SUV) by Sonication."

ii. Extrúzió

A lipidek extrúziója olyan technika, amelyben a lipidszuszpenziót egy meghatározott pórusmérettel rendelkező polikarbonát szűrőn keresztül préseljük, hogy olyan részecskéket kapjunk, amelyek átmérője közel van a használt szűrő pórusméretéhez. t Thumbnail he filter. A végső pórusméreten keresztül történő extrudálás előtt az LMV szuszpenziókat vagy több fagyasztási-olvasztási ciklussal, vagy a szuszpenzió nagyobb pórusméreten (jellemzően 0,2µm-1,0µm) keresztül történő előszűrésével bomlasztják. Ez a módszer segít megelőzni a membránok elszennyeződését, és javítja a végső szuszpenzió méreteloszlásának homogenitását. Mint az LMV-diszperziók méretcsökkentésére szolgáló összes eljárás esetében, az extrudálást a lipid Tc-je feletti hőmérsékleten kell végezni. A Tc alatti extrudálásra tett kísérletek sikertelenek lesznek, mivel a membrán hajlamos a merev membránokkal való szennyeződésre, amelyek nem tudnak átjutni a pórusokon. A 100 nm-es pórusú szűrőkön keresztül történő extrudálás jellemzően nagy, 120-140 nm-es átlagos átmérőjű, unilamelláris vezikulákat (LUV) eredményez. Az átlagos részecskeméret a lipidösszetételtől is függ, és tételről tételre meglehetősen jól reprodukálható.