A sejtek immunfluoreszcens jelölése

Az antitestek fontos eszközt jelentenek egy antigén jelenlétének és szubcelluláris lokalizációjának kimutatására. A sejtfestés nagyon sokoldalú technika, és ha az antigén erősen lokalizált, akár ezer antigénmolekulát is képes kimutatni egy sejtben. Bizonyos körülmények között a sejtfestés az antigén hozzávetőleges koncentrációjának meghatározására is használható, különösen képelemző készülékkel. A sejtfestés négy lépésre osztható: sejtelőkészítés, fixálás, antitest alkalmazása és kiértékelés

Az első lépésben a festendő sejteket szilárd hordozóra rögzítik, hogy a későbbi eljárások során könnyen kezelhetők legyenek. Ez többféle módszerrel is megvalósítható: a tapadó sejteket mikroszkópos tárgylemezre, fedőlemezre vagy optikailag megfelelő műanyag hordozóra lehet tenyészteni. A szuszpenziós sejteket üveglemezre centrifugálhatjuk, kémiai kötőanyagok segítségével szilárd hordozóhoz köthetjük, vagy bizonyos esetekben szuszpenzióban kezelhetjük.

A második lépés a sejtek rögzítése és permeabilizálása, hogy az antitest szabadon hozzáférjen az antigénhez. A tökéletes fixálás immobilizálja az antigéneket, miközben megőrzi az autentikus sejt- és szubcelluláris architektúrát, és lehetővé teszi az antitestek akadálytalan hozzáférését minden sejthez és szubcelluláris kompartmenthez. A fixálószerek széles skáláját használják általában, és a módszer helyes megválasztása a vizsgált antigén jellegétől és a használt antitest tulajdonságaitól függ. A fixáló módszerek általában két osztályba sorolhatók: szerves oldószerek és térhálósító reagensek. A szerves oldószerek, mint például az alkoholok és az aceton eltávolítják a lipideket és dehidratálják a sejteket, miközben kicsapják a fehérjéket a sejtarchitektúrán. A térhálósító reagensek (mint például a paraformaldehid) intermolekuláris hidakat képeznek, általában szabad aminocsoportokon keresztül, és így összekapcsolt antigének hálózatát hozzák létre. A térhálósító reagensek jobban megőrzik a sejtek szerkezetét, mint a szerves oldószerek, de csökkenthetik egyes sejtkomponensek antigén jellegét, és egy permeabilizációs lépés hozzáadását igénylik, hogy az antitest hozzáférjen a mintához. A mindkét módszerrel történő fixálás denaturálhatja a fehérjeantigéneket, és emiatt a denaturált fehérjék ellen készített antitestek hasznosabbak lehetnek a sejtfestéshez. Négy különböző fixálási módszert ismertetünk. A megfelelő fixálási módszert az adott alkalmazásnak megfelelően kell kiválasztani.

A sejtfestés harmadik lépése a sejtkészítmények antitesttel való inkubálása. A nem kötött ellenanyagot mosással eltávolítjuk, és a kötött ellenanyagot vagy közvetlenül (ha az elsődleges ellenanyag jelölt), vagy közvetve fluorokróm-jelölt másodlagos reagenssel detektáljuk.

A negyedik és egyben utolsó lépésben a festést fluoreszcens mikroszkópiával értékeljük.

Reagensek és felszerelések

1. Kultúrasejtek fedőlapokon tenyésztve
2. PBS: 0,01M foszfát pufferelt sóoldat, pH 7,2-7.4 (P3813 vagy P4417)
3.  
   1. Methanol, legalább 1 órán át -20 °C-on hűtve (terméksz. 32213)
   2. Aceton, legalább 1 órán át -20 °C-on hűtve (terméksz. 24201)

   vagy

   1. 3-4%-os paraformaldehid (termékszáma. P6148) PBS-ben. Oldjuk fel PBS-ben, 5N NaOH segítségével és enyhe melegítéssel
   2. 0,5% Triton X-100 (termékszáma: No. T9284)  PBS-ben

   vagy

   1. 3-4% paraformaldehid (termékszáma. P6148) PBS-ben. Oldjuk fel PBS-ben, 5N NaOH segítségével és enyhe melegítéssel
   2. Methanol, -20 °C-on hűtve legalább 1 órán keresztül (terméksz. 32213.)

   vagy

   1. PEM puffer:  P8203), 5 mM EGTA (termékszám:  P8203), 5 mM EGTA (termékszám. E4378), 2mM MgCl₂ - 6H₂O (terméksz. M0250). Hozza pH 6,8-ra NaOH oldattal
   2. Ethanol, -20 °C-on hűtve legalább 1 órán keresztül (terméksz. 270741)
4. Primer ellenanyag
5. Ellenanyag kontrollok
6. Szekunder ellenanyag-fluorokróm-jelölt
7. Vizes tartóközeg
8. Mikroszkóp üveg tárgylemezek (76 x 25 mm. Termékszám:  S8902)
9. Fluoreszcens mikroszkóp, megfelelő szűrővel felszerelve a fluoreszcencia detektálásához
10. Fénymikroszkópos fordított fénymikroszkóp (pl. Nikon TMS)

Eljárás

Cell előkészítés
Fixálás
Primer antitest alkalmazása
A másodlagos antitest alkalmazása
Értékelés

Megjegyzések:

1. Az alábbiakban általános protokollt adunk meg. Az elsődleges és másodlagos antitestek optimális hígításait, a sejtek előkészítését, a kontrollokat, valamint az inkubációs időket empirikusan kell meghatározni, és kiterjedt titrálást igényelhet. Ideális esetben az elsődleges antitestet a termék adatlapján ajánlott módon kell használni. A megfelelő negatív és pozitív kontrollokat is tartalmaznia kell.
2. A szükséges vegyszerek biztonságos kezeléséhez lásd a megfelelő SDS-t.
3. Védje a fluoreszcens konjugátumokat és a jelölt tárgylemezeket a fénytől. Inkubálja a mintákat sötétben és lehetőség szerint fedje le.

Cellák előkészítése

1. Vegye ki a sejteket az inkubátorból. Ellenőrizze inverz fénymikroszkóp alatt a kívánt megjelenést. Dobja el a táptalajt.
2. Öblítse le PBS-szel; távolítsa el a felesleges oldatot.

Fixálás

A sejtek fixálása:

Négy különböző fixálási módszert ismertetünk. Válassza ki a megfelelő fixálási módszert az alkalmazásnak (vagy a termék adatlapján szereplő ajánlásnak) megfelelően.

Methanol-aceton fixálás

1. Fixálás hűtött metanolban, 10 percig -20 °C-on.
2. Távolítsa el a felesleges metanolt.
3. Permeabilizálja hűtött acetonnal 1 percig -20 °C-on.

vagy
Paraformaldehid-Triton fixálás

1. Fixálás 3-4%-os paraformaldehidben 10-20 percig.
2. Rövid öblítés PBS-szel.
3. Permeabilizáljuk 0,5%-os Triton X-100-zal 2-10 percig.

vagy
Paraformaldehid-metanol fixálás

1. Fixáljuk 3-4%-os paraformaldehidben 10-20 percig.
2. Röviden öblítsük le PBS-szel.
3. Permeabilizáljuk lehűtött metanollal 5-10 percig -20 °C-on.

vagy
PEM-etanolos fixálás

1. Fixáljuk PEM-pufferben 10 percig.
2. Öblítsük le kétszer, röviden PBS-szel.
3. Permeabilizáljuk lehűtött etanollal 5-10 percig -20 °C-on.

Mossuk háromszor (egyenként legalább 5 percig) PBS-szel.

A primer ellenanyag alkalmazása

1. Hígítsuk fel a primer ellenanyagot PBS-ben megfelelő hígításra. Vigye fel a fedőlemezekre a sejtek fölé, és inkubálja 60 percig szobahőmérsékleten (ajánlott párásított kamrát használni).
2. Mosson háromszor (egyenként legalább 5 percig) PBS-szel.

Szekunder antitest alkalmazása

Megjegyzés: A másodlagos ellenanyagot csak indirekt vizsgálatoknál alkalmazzuk.

1. A megjelölt másodlagos ellenanyagot megfelelő hígításra hígítsa fel PBS-ben. Vigye fel a fedőlapokra, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten.
2. Mosson háromszor (egyenként legalább 5 percig) PBS-szel.
3. Eltávolítsa a felesleges PBS-t.

Ellenőrzés

1. Meghordjuk a fedőlemezeket a fedőközeggel, és üveglemezekre fordítjuk.
2. Vizsgáljuk meg mikroszkóp alatt.
3. Jegyezzük fel az eredményeket. Ajánlatos lefényképezni a megjelölt sejteket.

Megjegyzés: Célszerű a megfelelő negatív kontrollokat lefuttatni. A negatív kontrollok megállapítják a háttérfluoreszcenciát és az elsődleges és másodlagos antitestek nem specifikus festődését. Az ideális negatív kontrollreagens egy fluorokróm konjugált egér monoklonális vagy myeloma fehérje. Ennek izotípus-illeszkedőnek kell lennie, nem specifikusnak a vizsgált faj sejtjeire, és ugyanolyan koncentrációjúnak, mint a vizsgált antitest. Az autofluoreszcencia vagy a negatív kontrollreagens fluoreszcenciájának mértéke a vizsgált sejtek típusától és a használt műszer érzékenységétől függően változik. Az Fc-receptorokkal rendelkező sejtek fluoreszcens analíziséhez kötelező az izotípushoz illeszkedő negatív kontrollok használata.

Hivatkozások

1. Giloh H, Sedat J. 1982. Fluorescence microscopy: reduced photobleaching of rhodamine and fluorescein protein conjugates by n-propyl gallate. Science. 217(4566):1252-1255. https://doi.org/10.1126/science.7112126

2. Storz H, Jelke E. 1984. Photomicrography of weakly fluorescent objects ? employment of p-phenylene diamine as a blocker of fading. Acta Histochemica. 75(2):133-139. https://doi.org/10.1016/s0065-1281(84)80048-3

3. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

4. Johnson G, Davidson R, McNamee K, Russell G, Goodwin D, Holborow E. 1982. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. Journal of Immunological Methods. 55(2):231-242. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90035-7

5. Longin A, Souchier C, Ffrench M, Bryon PA. 1993. Comparison of anti-fading agents used in fluorescence microscopy: image analysis and laser confocal microscopy study.. J Histochem Cytochem.. 41(12):1833-1840. https://doi.org/10.1177/41.12.8245431

6. Beesley J. 1993. Immunocytochemistry: A Practical Approach. Oxford University Press.

7. Bullock G, Petrusz P. 1989. Techniques in Immunocytochemistry. 1. Academic Press.