Proteázy pro odstraňování značek při purifikaci rekombinantních proteinů
Spolehlivá a robustní metoda purifikace proteinů zahrnuje mnoho aspektů, včetně výběru správných kolon pro chromatografii, kalibrace optimálních vazebných a elučních podmínek a pořadí purifikačních kroků. Exprese rekombinantního proteinu je běžně používanou možností, pokud je požadován čistý protein ve velkém množství. Jednou z výhod rekombinantní exprese proteinu je možnost modifikovat gen kódující protein, aby se zvýšila rozpustnost proteinu a usnadnilo čištění pomocí kolonových purifikačních metod. Mezi běžně modifikované sekvence nebo značky patří 6xHIS-tag a FLAG®-tag nebo přidání domén GST, MBP a SUMO. Běžně se také používá přidání biotinu a biotinylovaných látek k proteinu, který je předmětem zájmu, protože díky silné nekovalentní vazbě na streptavidinovou kolonu je vhodnou volbou pro získání proteinů vysoké čistoty. Prozkoumejte naši nabídku doporučených činidel pro purifikaci proteinů s biotinem v tabulce výběru produktů níže.
Biotinylované proteázy pro purifikaci proteinů štěpením na koloně
Často je třeba odstranit purifikační značku nebo nosný protein, protože může narušovat aktivitu purifikovaného proteinu. Kromě toho se různá průmyslová odvětví řídí přísnými regulačními směrnicemi, které často vyžadují proteiny bez značek, a odstranění značek může být vyžadováno pro následné purifikace. Pro usnadnění proteolytického oddělení značky a proteinu zájmu během purifikace se mezi purifikační značku nebo nosnou doménu a protein často zavádí jedna z několika rozpoznávacích sekvencí proteáz (obr. 1).
Důležité je, že tyto proteázy odstraňující značku musí být specifické a musí mít rozpoznávací sekvenci, která se v proteinu zájmu neobjeví náhodně. Mezi běžně používané proteázy patří TEV, HRV-3C, trombin a SUMO (tabulka 1). SUMO proteáza se liší tím, že nerozpoznává malou rozpoznávací sekvenci, ale vlastní sekundární strukturu domény SUMO a štěpí kompletní doménu SUMO, aniž by na proteinu zájmu zanechala další aminokyseliny. V důsledku toho je proteáza SUMO obvykle nejlepším řešením, pokud je požadována autentická N-terminální sekvence.
Obrázek 1.Příklad strategie purifikace fúzního proteinu pomocí proteázy pro odstranění značky ze zájmového proteinu a následné analýzy pomocí SDS-PAGE.
Pracovní postupy purifikace proteinů, které zahrnují odstranění značek, často vyžadují, aby byl značený protein nejprve eluován z afinitní pryskyřice. Pro usnadnění odstranění značky se přidá proteáza, která značku odštěpí, a provede se další purifikační krok, aby se odstraněná značka a zbývající proteáza oddělily od proteinu, který je předmětem zájmu. Alternativní strategií je odštěpení zájmového proteinu od fúzní značky v době, kdy je navázána na afinitní kolonu. Tato strategie je výhodná, protože má tendenci zvyšovat úroveň čistoty eluovaného proteinu, eliminuje potřebu dalších kroků a umožňuje flexibilitu ve složení elučního pufru. Tato strategie však může být náročná, protože proteáza odstraňující značku nese stejnou purifikační značku jako protein zájmu, což vede k vazbě proteázy odstraňující značku na afinitní pryskyřici, která stericky omezuje její proteolytickou aktivitu.
Bpurifikace proteinů s obsahem izotinu
Jako řešení dříve zmíněného problému omezené proteolytické aktivity nyní nabízíme verze nejoblíbenějších proteáz pro odstraňování značek. Naše proteázy neobsahují běžné purifikační značky, včetně His-tagu, FLAG®-tag činidel, GST &; MBP, takže se tyto proteázy nevážou na žádnou běžnou afinitní purifikační pryskyřici, což umožňuje maximální aktivitu odstraňování značek. Vzhledem k tomu, že typické množství přidané proteázy je menší než 1 % eluovaného proteinu, nemusí být nutné proteázu odstraňující značky vůbec odstraňovat. Několik našich proteáz je však v případě potřeby odstranění značky také biotinylováno, což umožňuje rychlé a snadné odstranění proteázy pomocí libovolné pryskyřice s avidinem nebo streptavidinem (Obrázek 2 a Tabulka 1).
Obrázek 2.Proces odstraňování značek na koloně eliminuje většinu nečistot, které se vážou na afinitní pryskyřice, včetně proteinů vázajících kovy na Ni-chelatačních kolonách, a umožňuje šetrnější podmínky eluce s větší flexibilitou složení elučního pufru.
Níže uvedené údaje ze vzorků ukazují zlepšení čistoty při použití metod eluce proteázou s odstraněním značek (obrázek 3 & amp; 4). Protein značený His byl v tomto příkladu eluován buď pomocí imidazolu, nebo štěpením na koloně pomocí proteázy HRV-3C značené biotinem. Jak je vidět z analýzy SDS-PAGE, eluce na koloně poskytuje vyšší čistotu konečného proteinu s menším množstvím nečistot viditelných na gelu.
Obrázek 3.Analýza SDS-PAGE purifikace cílového proteinu pomocí štěpení proteinu na koloně. Pruh 1: Purifikovaný cílový protein eluovaný štěpením na koloně pomocí biotinem značené HRV-3C proteázy (kat. č. SAE0110), pruh 2: cílový protein purifikovaný pomocí imidazolu (kat. č. I202).
Obrázek 4.Stupeň biotinylace trombinové proteázy (kat. č. SAE0147), značené biotinem, analyzovaný pomocí testu gelového posunu. Pruh 1: Posun gelu se streptavidinem, pruh 2: Bez streptavidinu.
Další průvodce purifikací proteinů značených biotinem najdete v našem Purifikace nebo odstranění biotinu a biotinylovaných látek a naše Purification or Removal of Biotin and Biotinylated Biomolecules with Magnetic Beads stránky zdrojů.
Eúčinné odstranění biotinylovaných proteinů
Důležité je, aby stupeň biotinylace byl dostatečně vysoký pro účinné odstranění biotin-proteázy. Jakákoli nebiotinylovaná proteáza se nebude vázat na streptavidin, a proto nebude z konečného čistého proteinového přípravku odstraněna. Každá šarže našich katalogových produktů proteáz značených biotinem je testována na stupeň biotinylace, aby se ověřilo, že je ≥ 90 %. Tato kontrola kvality zajišťuje, že po přidání streptavidinu lze proteázu účinně odstranit.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?