Purifikace nebo odstranění biotinu a biotinylovaných látek

Streptavidinová sepharosa s vysokou účinností

Biotin a biotinylované látky se vážou na streptavidin, molekulu izolovanou ze Streptomyces avidinii. Vazba streptavidinu na biotin je jednou z nejsilnějších známých nekovalentních biologických interakcí. Proto jsou pro efektivní eluci biotinylovaných biomolekul obecně nutné denaturační podmínky. Alternativně lze k zachycení interagujících cílových látek, jako jsou proteiny, použít biotinylované biomolekuly navázané na streptavidinová chromatografická média. Nečistoty se odstraní promytím a obohacený cílový protein se eluuje za použití relativně mírných elučních podmínek.

Vlastnosti chromatografického média

Vlastnosti média Streptavidin Sepharose High Performance AC jsou uvedeny v tabulce 3.5

.

Tabulka 3.5 Charakteristika média pro vysokoúčinnou chromatografii se sefarosou streptavidinu

	Složení	PH stabilita1	Průměrná velikost částic (µM)
Streptavidinová sepharosa High Performance	Streptavidin je spojen se sepharosou High Performance pomocí N-hydroxysukcinimidové spojovací metody.	Krátkodobé: 2 až 10,5 Dlouhodobé: 4 až 9	34

¹Krátký termín označuje interval pH pro regeneraci, čištění na místě a sanitační postupy. Dlouhodobý termín se týká intervalu pH, při kterém je médium dlouhodobě stabilní bez nepříznivých účinků na jeho následnou chromatografickou výkonnost.

Možnosti purifikace

Streptavidinová separaóza High Performance je k dispozici v baleních chromatografických médií a je balena v HiTrapu<.sup>® 1 ml kolonách, 96jamkových destičkách MultiTrap™ a minikolonách SpinTrap™ (tabulka 3.6). Tyto různé formáty lze použít pro purifikaci a obohacování proteinů, kdy je biotinylovaná protilátka (nebo jiná biotinylovaná molekula) připojena ke streptavidinu a protein zájmu je obohacen díky afunkční interakci s protilátkou/cílovou molekulou.

Pro imunoprecipitaci a purifikaci biotinylovaných molekul v malém měřítku jsou k dispozici také magnetické kuličky Streptavidin Mag Sepharose.

Tabulka 3.6. Možnosti purifikace vysoce účinných chromatografických médií a předbalených kolonek se streptavidinem

	Vázací kapacita	Maximální provozní fl.ow	Komentáře
HiTrap® Streptavidin HP, 1 ml	Biotin, > 300 nmol/kolona . Biotinylovaná BSA, médium 6 mg/ml	4 ml/min	Předplněná kolona o objemu 1 ml.
Streptavidinová sepharosa vysoké účinnosti	Biotin, > 300 nmol/prostředek	Biotin, > 300 nmol/prostředekbr> Biotinylovaná BSA, 6 mg/ml médium	150 cm/h1	Dodává se jako suspenze připravená k balení na kolonu.
Streptavidin HP MultiTrap™	Biotin, > 15 nmol/jamku Biotinylovaná BSA, 0.3 mg/jamku	Nepoužije se	96jamková filtrační destička.
Streptavidin HP SpinTrap™	Biotin, > 30 nmol/sloupec Biotinylovaná BSA, 0.6 mg/kolona	Nepoužije se	K použití se stolní odstředivkou.

¹ Viz Příloha 4 k převodu rychlosti proudění (cm/h) na objemovou rychlost proudění (ml/min). Maximální provozní flow se vypočítá z měření v plněné koloně s výškou lože 10 cm a i.d. 5 cm.

Příklad značení

Alternativou značení biomolekuly, například protilátky, biotinem je použití 2-iminobiotinu, který se váže na streptavidin při pH nad 9,5 a lze jej eluovat při pH 4,0 (obrázek 3.5).

Obrázek 3.5. Purifikace iminobiotinylované BSA na HiTrap® Streptavidin HP, 1 ml.

Často je žádoucí obohacení určitého proteinu, aby se zvýšil jeho signál v následných krocích analýzy. V tomto příkladu byl pro obohacení lidského transferinu ze vzorku E. coli použit Streptavidin HP SpinTrap™. Koncentrace proteinu, který nás zajímá, činila 0,15 % celkového obsahu bílkovin v E. coli, což přibližně odpovídá koncentraci středně zastoupeného proteinu. Zachycení transferinu bylo dosaženo pomocí biotinylované protilátky (polyklonální králičí protilátka proti lidskému transferinu imobilizovaná na médiu).

Analýza pomocí SDS-PAGE odebraných frakcí z běhů odhalila signifikantní obohacení transferinu (obrázek 3.6). Výtěžnost výchozího materiálu byla 60 až 70 %, přičemž většina proteinu byla eluována v prvním filtračním kroku. Obohacení transferinu v porovnání s výchozím materiálem bylo u Streptavidin HP SpinTrap™ přibližně stonásobné.

Obrázek 3.6. Obohacení transferinu z buněčného lyzátu E. coli. (A) Analýza pomocí SDS-PAGE (promývací kroky 2 a 4 byly z gelu vynechány). Gel byl dodatečně obarven Deep Purple Total Protein Stain a naskenován. (B) Všechny tři eluční kroky byly analyzovány pomocí softwaru ImageQuant™ TL. Je zobrazena výtěžnost (procento výchozího materiálu) tří opakování.

Provedení separace

HiTrap^® Streptavidin HP

Následující protokol popisuje AC pomocí HiTrap^® Streptavidin HP 1 ml kolony stříkačkou, pomocí pumpy nebo chromatografického systému.

Biotinylované látky

Vazný pufr:	20 mM fosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH 7.5
Eluční pufr:	8 M guanidin-HCl, pH 1.5 Iminobiotinylované látky
Vazný pufr:	50 mM uhličitan amonný, 500 mM NaCl, pH 10.0
Eluční pufr:	50 mM octan amonný, 500 mM NaCl, pH 4,0

1. Kolonu vyrovnejte pomocí 10 CV vazebného pufru.
2. Naneste vzorek. Pro dosažení optimálních výsledků použijte při aplikaci vzorku nízkou rychlost flow 0,1 až 0,5 ml/min.
3. Promyjte kolonu nejméně 10 CV vazebného pufru nebo dokud se v eluentu neobjeví žádný materiál (sledováno UV absorpcí při A₂₈₀ nM).
4. Vyluhujte 10 až 20 CV elučního pufru.¹

¹ Vzhledem k tomu, že podmínky eluce mohou být poměrně tvrdé, shromážděte frakce do neutralizačního pufru (100 až 200 µl 1 M Tris-HCl, pH 9.0  na ml frakce), aby finální pH frakcí bylo přibližně neutrální, nebo proveďte rychlou výměnu pufru  na odsolovací koloně (viz Výměna pufru a odsolování, Příloha 1).

Drsné podmínky nutné k přerušení vazby streptavidin-biotin mohou ovlivnit vzorek i ligand. Streptavidinové sefarozové kolony nelze po eluci za těchto podmínek znovu použít.

Purifikace antigenů

Antigeny lze purifikovat z biotinylovaných komplexů biomolekul (často protilátek) a antigenů navázaných na streptavidin. Následující metoda je upravena pro HiTrap^® Streptavidin HP.

Solubilizační pufr:	20 mM fosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH 7.5 s 0,1 % SDS, 1,0 % Nonidet™-P-40, 0,5 % deoxycholátu sodného
Eluční pufr:	100 mM glycin-HCl, pH 2,2

1. Solubilizujte antigen příslušným množstvím solubilizačního pufru, vyčistěte vzorek odstředěním při 12 000 × g po dobu 15 min.
2. Přidejte biotinylovanou protilátku a upravte objem na 1 ml.
3. Inkubujte s mícháním konec na konec po dobu nejméně 1 h nebo přes noc.
4. Kvibrujte kolonu s 10 CV solubilizačního pufru.
5. Přidávejte roztok protilátky a antigenu na kolonu při nízké rychlosti průtoku, např. 0,2 ml/min. Pokud je objem vzorku menší než 1 ml, naneste vzorek a nechte několik minut působit, aby došlo k navázání.
6. Vymyjte nenavázaný vzorek 10 CV solubilizačního pufru nebo dokud se v eluentu nenachází žádný materiál (sledováno UV absorpcí při A₂₈₀ nM).
7. Vymyjte 5 až 10 CV elučního pufru¹.

¹ Vzhledem k tomu, že eluční podmínky jsou poměrně tvrdé, doporučuje se sbírat frakce do neutralizačního pufru (100 až 200 µl 1 M Tris-HCl, pH 9.0 na 1 ml frakce), aby finální pH frakcí bylo přibližně neutrální, nebo provést rychlou výměnu pufru na odsolovací koloně (viz Výměna pufru a odsolování, Příloha 1).

Streptavidin HP MultiTrap™ Materials 96-well plate

Protokol je určen k obohacování cílových proteinů pomocí imobilizovaných protilátek. Odstřeďte 96jamkové destičky MultiTrap™ při 700 × g nebo použijte vakuum. Pokud použijete vakuum, použijte -0,15 baru, dokud nebudou jamky prázdné, a poté pomalu zvyšujte vakuum na -0,3 baru (nepoužívejte větší vakuum než -0,5 baru). Přibližně po 5 s vakuum vypněte.

Před odstraněním kapaliny v ekvilibračním, promývacím a elučním kroku promíchejte briefly, abyste zvýšili účinnost kroku. Doporučuje se inkubace na třepačce destiček. Nezapomeňte mezi jednotlivými kroky vyměnit nebo vyprázdnit sběrnou destičku.

Vazný pufr:	TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5)
Vymývací pufr:	TBS s 2 M močovinou, pH 7.5
Eluční pufr:	100 mM glycin s 2 M močovinou, pH 3.0
Blokující pufr:	2 mM biotin v TBS

1. Odstraňte skladovací roztok

        A. Zavěste médium jemným zatřesením desky dnem vzhůru.

        B. Odstraňte horní a spodní těsnění a položte desku na sběrnou desku.

        C. Odstraňte horní a spodní těsnění a položte desku na sběrnou desku. Odstraňte zásobní roztok odstředěním po dobu 1 min při 700 × g.

2. Ekvilibrace pro imobilizaci (tento krok proveďte třikrát)

        A. Přidejte 400 µl vazebného pufru do každé jamky, promíchejte briefly a odstřeďujte 1 min při 700 × g, aby se médium vyrovnalo.

3. Vazba biotinylované protilátky

        A. Bezprostředně po ekvilibraci přidejte 200 µl roztoku biotinylované protilátky na jamku (0,5 µl roztoku).1 až 1,0 mg/ml ve vazebném pufru).

        B. Inkubujte na třepačce po dobu 20 min.

        C. Odstřeďujte 1 min při 700 × g, abyste odstranili nenavázanou protilátku.

4. Blokování (tento krok proveďte dvakrát)

        A. Přidejte 400 µl blokovacího pufru na jamku a inkubujte na třepačce po dobu 5 min, aby se zablokovala volná vazebná místa biotinu.

        B. Odstřeďujte po dobu 1 min při 700 × g.

5. Odstřeďujte po dobu 1 min při 700 × g. Promývání (tento krok proveďte třikrát)

        A. Přidejte 400 µl vazebného pufru na jamku a promíchejte briefly.

        B. Odstřeďujte 1 minutu při 700 × g.

6. Odstřeďujte 1 minutu při 700 × g. Vazba cílového proteinu

        A. Přidejte 200 µl klarifikovaného vzorku ve vazebném pufru do každé jamky a inkubujte na třepačce po dobu 60 min.

        B. Odstřeďujte 1 min při 700 × g, aby se vymyl nenavázaný protein. Shromážděte flowthrough.

7. Odstředění: Odstředěte a nechte projít varem. Promývání

        A. Přidejte 400 µl vazebného/ promývacího pufru na jamku a promíchejte briefly.

        B. Odstřeďujte 1 min při 700 × g. Tento krok proveďte celkem fináctkrát. (Shromážděte a uložte promývání pro případ, že by bylo nutné řešit potíže).

8.

Vypláchněte a uložte promývání. Eluce (tento krok proveďte třikrát)

        A. Přidejte 200 µl požadovaného elučního pufru a protřepávejte 1 min.

        B. Odstřeďujte 1 min při 700 × g.

        C. Shromážděte eluáty do oddělených sběrných destiček.

Streptavidinové kolonky HP SpinTrap™

Tento protokol je určen k obohacování cílových proteinů pomocí imobilizovaných protilátek. V každém kroku umístěte kolonku SpinTrap™ do čerstvé 2ml mikrocentrifugační zkumavky pro sběr kapaliny. Víčka a spodní uzávěry kolony Streptavidin HP SpinTrap™ se používají během inkubace a eluce, ale ne během ekvilibrace a promývání. Před centrifugací sejměte spodní uzávěr a mírně otevřete víčko (otočte víčkem ~ 90º proti směru hodinových ručiček).

Vazný pufr:	TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5)
Vymývací pufr:	TBS s 2 M močovinou, pH 7.5
Eluční pufr:	100 mM glycin s 2 M močovinou, pH 2.9
Blokující pufr:	2 mM biotin v TBS

1. Vyjměte zásobní roztok

        A. Odlomte spodní uzávěr z odstředivé kolony. Spodní uzávěr si uschovejte.

        B. Odstraňte zásobní roztok odstředěním po dobu 1 min při 150 × g.

2. Ekvilibrace pro imobilizaci (tento krok proveďte třikrát)

        A. Přidejte 400 μl vazebného pufru a odstřeďujte 1 min při 150 × g, aby se médium vyrovnalo.

        B. Odstraňte vazebný pufr.

3. Odstraňte vazebný pufr. Vazba biotinylované protilátky

        A. Ihned po ekvilibraci přidejte 200 μl biotinylované protilátky 0,1 až 1,0 mg/ml).

        B. Plně suspendujte médium ručním převrácením a inkubujte za pomalého míchání konec na konec po dobu 20 min při pokojové teplotě.

        C. Odstřeďujte 1 min při 150 × g, abyste odstranili nenavázanou protilátku.

4. Odstřeďujte 1 min při 150 × g. Blokování (tento krok proveďte dvakrát)

        A. Přidejte 400 μl blokovacího pufru.

        B. Přidejte 400 μl blokovacího pufru. Promíchejte ručním převrácením a inkubujte s mícháním na konci na konci po dobu 5 min, aby se zablokovala volná vazebná místa biotinu.

        C. Odstřeďujte po dobu 1 min při 150 × g.

5. Odstřeďte po dobu 1 min při 150 × g. Promývání (tento krok proveďte třikrát)

        A. Přidejte 400 μl vazebného pufru a odstřeďujte 1 min při 150 × g.

6. Promytí. Vazba cílového proteinu

        A. Přidejte 200 μl vyčištěného vzorku do vazebného pufru.

        B. Promíchejte ručním převrácením a inkubujte za pomalého míchání konec na konec po dobu 60 min při pokojové teplotě.

        C. Odstřeďujte 1 min při 150 × g, aby se vymyl nenavázaný protein. Shromážděte průtok.

7. Promývání (tento krok proveďte pětkrát)

        A. Přidejte 400 μl promývacího pufru a odstřeďujte 1 min při 150 × g.

        B. Během optimalizace/řešení problémů: Sbírejte průtok.

8. Eluce (tento krok proveďte třikrát)

        A. Přidejte 200 μl požadovaného elučního pufru a promíchejte inverzí.

        B. Odstřeďujte 1 min při 1000 × g.

        C. Shromážděte eluáty do jednotlivých zkumavek.

Skladování

Chromatografická média a HiTrap^® kolony promyjte 20% ethanolem (použijte přibližně 5 CV pro balená média) a skladujte při teplotě 4 °C až 8 °C. Nástroje Streptavidin MultiTrap™ a Streptavidin SpinTrap™ jsou určeny pouze k jednorázovému použití.