Purifikace protilátek pomocí proteinu A/G/L agarózy

Tento protokol je navržen jako rychlá metoda purifikace protilátek ze savčích sér, ascitů a supernatantů buněčných kultur. Je třeba poznamenat, že pokud je výchozím materiálem sérum nebo ascites, bude konečný přípravek obsahovat endogenní IgG hostitele i specifické protilátky. Obecně by přítomnost tohoto endogenního IgG neměla narušovat testy používající protilátky. Obsah imunoglobulinů v normálních sérech několika druhů a ze zdrojů monoklonálních protilátek je uveden v Tabulka (PDF).

Poznámka: Nabízíme PURE1A Sadu pro purifikaci protilátek pomocí proteinu A.

Protokol purifikace
Reagenty a vybavení
Procedura

Protokol čištění (pro kolonu o objemu 1 ml)

Poznámky: Tento protokol používá pro Protein A pufr s vysokou molaritou a vysokým pH, aby se zvýšila vazba podtříd se slabou afinitou k Proteinu A (např. myší IgG1). Vazba na Protein G a L probíhá při neutrálním pH, proto se jako nakládací pufr používá fosfátový pufr. Eluce navázaného Ig se provádí v jediném kroku citrátovým pufrem o pH 3, který odstraní všechny podtřídy, které se navázaly na pryskyřici. Kapacitu proteinu A a proteinu G pro IgG z různých druhů lze odhadnout z relativních afinit uvedených v Tabulka (PDF). Podtřída IgG s 1-2 plusy bude vázat 1-5 mg IgG na ml pryskyřice. Podtřída se 3-4 plusy se bude vázat v množství 10-25 mg na ml pryskyřice. Protein L je schopen vázat všechny třídy Ig a u druhů se 4 plusy může vázat 3-10 mg Ig na ml pryskyřice. Doporučuje se, aby pryskyřice, která se má použít, měla alespoň 2 plusy pro druh a třídu Ig materiálu, který se má purifikovat.

Reagencie a vybavení

1. Sérum, ascites nebo supernatant buněčné kultury
2. Načítací pufr pro protein A: 1 M fosforečnan draselný, pH 9,0
3. Protein G nebo L Loading Buffer: (č. produktu P4417)
4. Elution Buffer: 0,01M fosfátový pufr (PBS), pH 7,4: 0,1 M kyselina citronová, pH 3,0
5. 1,5 M Tris báze, pro neutralizaci eluátu
6. 3 - 5 ml injekční stříkačka (pouzdro kolony), skleněná vata
7. Stopcock, Luer-Lock (výrobek č. S7396)
8. Kroužkový stojan, svorka
9. Testovací zkumavky, stojan
10. Spektrofotometr, kyvety
11. PH metr
12. Transferové pipety, baňky
13. Kádinky, míchadla a míchací deska (pro přípravu pufru)
14. Sterilní filtrační jednotky (volitelné)
15. Azid sodný (konzervační látka) (produkt č. 1)
16. Přípravek pro přípravu pufru (produkt č. 2) (např. S2002)
    

Postup

1. Připravte pufry. Pufry lze skladovat při teplotě 4 °C po dobu 1-2 týdnů. Filtrace přes sterilní filtrační jednotky prodlouží životnost pufrů, ale není nutná.
2. Připravte pouzdro na kolonu. Odstraňte píst ze stříkačky a zlikvidujte jej. Do dna stříkačky vtlačte malé množství skelné vaty, tolik, aby vytvořila polštářek o tloušťce asi 1/2 - 1 cm. Připevněte uzavírací kohout. Vypláchněte 1-2 ml nakládacího pufru. Ujistěte se, že polštářek ze skleněné vaty zůstává pevně na dně stříkačky.
3. Pryskyřici suspendujte ve 2 ml nakládacího pufru převrácením a otáčením lahvičky. Vyhněte se nadměrnému třepání. Nevířte suspenzi.
4. Nalijte suspenzi do injekční stříkačky. Nechte přebytečný pufr odtéct a poté promyjte kolonu 5 ml nakládacího pufru. Nenechte pryskyřici zcela vyschnout.
5. Pokud je to možné, odhadněte množství Ig v séru, ascitu nebo supernatantu, které se má načíst. Pokud množství Ig není známo, Tabulka (PDF) obsahuje přibližné hladiny Ig v séru různých druhů, v myším ascitu a v supernatantu buněčných kultur, které lze použít k odhadu množství Ig ve výchozím materiálu. Na základě kapacity pryskyřice pro Ig z druhu výchozího materiálu (viz poznámky výše) a množství Ig ve výchozím materiálu vypočítejte objem k načtení.
   
   Poznámka: Jedná se o přibližné hodnoty, které lze použít pouze jako počáteční vodítko. Skutečné koncentrace Ig v tekutinách a vazba na pryskyřice se budou lišit a optimální poměr výchozího materiálu a pryskyřice je třeba stanovit experimentálně.
   
   
6. Sérum nebo ascites zřeďte 3 objemy nakládacího pufru. Supernatant nařeďte 1 objemem zavaděcího pufru.
7. Naneste naředěný materiál na kolonu. Nenavázanou frakci shromážděte do zkumavky nebo kádinky a uschovejte pro případné další zpracování. Propláchněte nenavázané proteiny pomocí 5 ml nakládacího pufru na 1 ml pryskyřice.
8. Naneste na kolonu elution buffer. Shromážděte frakce o objemu 1/2 objemu kolony. Použijte 10 ml elučního pufru na 1 ml pryskyřice.
9. Znovu ekvilibrujte kolonu pomocí 5 ml nakládacího pufru na 1 ml pryskyřice. Zkontrolujte pH výtoku, abyste se ujistili, že je kolona vyrovnána na pH nakládacího pufru.
10. Prověřte eluční frakce na přítomnost proteinu pomocí absorbance při 280 nm. (V případě potřeby lze provést vizuální stanovení pomocí soupravy Total Protein Kit.)
11. Frakce, které jsou pozitivní na přítomnost bílkovin, shromážděte. Neutralizujte na pH 6 - 8 pomocí 1,5 M Tris báze.
12. Pokud je to žádoucí, lze nenavázanou frakci znovu aplikovat na kolonu, aby se získaly všechny Ig, které se při prvním průchodu nenavázaly, což se může stát, pokud množství vloženého materiálu přesáhne kapacitu kolony.
13. Dialyzujte do požadovaného pufru, tj. do PBS, pH 7, při 4 °C. Objem dialyzačního pufru by měl být nejméně 20násobkem objemu roztoku proteinu. Měly by být provedeny nejméně 2 výměny dialyzačního pufru, každá po dobu nejméně 2 - 4 hodin, aby byla zajištěna úplná ekvilibrace v dialyzačním pufru.
14. Pokud se již nemají provádět další běhy, promyjte kolonu PBS obsahujícím 0,05 - 0,1 % azidu sodného. Kolonu uzavřete zátkou nebo Parafilmem a uchovávejte při teplotě 4 °C.
    
    Poznámka: V případě potřeby je možné separovat izotypy myšího a lidského IgG z proteinu A pomocí gradientotvorného zařízení (tj.Produkt č. G6897) k vytvoření lineárního gradientu pH v 0,1 M citrátovém pufru probíhajícího od pH 6,5 do pH 3,0. Celkový objem gradientu by měl být alespoň desetinásobkem objemu kolony. Nevýhodou této metody eluce je, že při ní vzniká několik píků, z nichž každý musí být neutralizován a testován, a že jejím výsledkem je mnohem více zředěný produkt než při jednostupňové eluci.