Sada markerů pro gelovou filtraci pro proteiny s molekulovou hmotností 12 000-200 000 Da
MWGF200
Skladovací teplota -20 °C
Popis produktu
Gelová filtrační chromatografie je zavedená metoda pro stanovení velikosti a molekulové hmotnosti proteinů. Frakcionace je založena na difúzi molekul do pórů pryskyřice. Větší proteiny nevstupují do pórů pryskyřice tak snadno, ale procházejí objemem tekutiny kolony rychleji než menší proteiny. Tyto molekuly bílkovin se z kolony eluují v pořadí klesající molekulové hmotnosti.
Stanovení molekulové hmotnosti neznámých bílkovin se provádí porovnáním poměru Ve/Vo pro danou bílkovinu s Ve.e/Vo proteinových standardů o známé molekulové hmotnosti (Ve je eluční objem a Vo je objem prázdného prostoru). Vo dané kolony vychází z objemu výtoku potřebného pro eluci velké molekuly, jako je modrý dextran (molekulová hmotnost ~2 000 kDa, katalogové číslo 2), a z objemu výtoku potřebného pro eluci velké molekuly, jako je modrý dextran (molekulová hmotnost ~2 000 kDa, katalogové číslo 2). D4772). Vynesením logaritmů známých molekulových hmotností proteinových standardů oproti jejich příslušným hodnotám Ve/Vo se získá lineární kalibrační křivka.
Ve/Vo je v podstatě nezávislá na velikosti kolony a koncentraci proteinu, ale u některých proteinů může být závislá na teplotě. Nespolehlivé molekulové hmotnosti lze získat, pokud protein tvoří komplex s gelem, obsahuje velké množství sacharidů, agreguje do větších komplexů nebo za použitých podmínek disociuje na podjednotky.1 Molekulovou hmotnost nečistého proteinu lze tímto postupem stanovit, pokud je pro daný protein k dispozici specifický detekční test.
Postup stanovení molekulových hmotností pomocí gelové filtrační chromatografie, jak je popsán v tomto bulletinu, je modifikací publikovaných metod.1,2 Proteinové standardy v této soupravě mohou být vhodné pro použití v jiných chromatografických systémech včetně HPLC, ačkoli se zdá, že některé pufrovací systémy mění eluční objemy .nbsp;albuminu (A8531) a karboanhydrázy (C7025). Proteiny v Soupravě MWGF200 mají rozsah molekulových hmotností od 12,4-200 kDa.
Reagencie |
|---|
Upozornění a prohlášení o vyloučení odpovědnosti
Tento výrobek je určen pouze pro výzkum a vývoj, nikoliv pro léky, domácnost nebo jiné použití. Informace o nebezpečnosti a bezpečném zacházení naleznete v bezpečnostním listu.
Skladování/Stabilita
Sadu skladujte při teplotě -20 °C.
Postup
Použití .MWGF200 pro gelovou filtrační chromatografii
- Pufr a pryskyřice - Doporučuje se použít 50 mM Tris-HCl, pH 7. V případě, že je to nutné, použijte pufr a pryskyřici.5,se 100 mM KCl jako ekvilibrační pufr s rozměry 90 cm x 1,6 cm Sephacryl® S-200-HR (katalogové číslo: S-200-HR). S200HR) kolona při 2-8 °C. Informace o přípravě pryskyřice, balení kolony a ekvilibraci získáte od technického servisu.
- Stanovení objemu (Vo) - Rozpusťte modrý dextran v ekvilibračním pufru obsahujícím 5% glycerol o koncentraci 2 mg/ml. Tato koncentrace modrého dextranu poskytne ve frakci píku hodnotu A280 ~1,0. Glycerol se přidává pro zvýšení hustoty roztoku, ale jeho použití není povinné.
Doporučený objem vzorku je menší než 2 % celkového objemu gelového lože. Opatrně naneste vzorek modrého dextranu na kolonu (nenarušujte povrch gelového lože), abyste určili Vo a zkontrolovali balení kolony. Ihned po nanesení vzorku začněte sbírat frakce o objemu 0,5-1,5 % celkového objemu gelového lože. Průtok by měl být ~7 % objemu kolony za hodinu. Zkosení modrého dextranového pásu představuje závadu na koloně, ačkoli určitý chvost je normální. Vedoucí pík označuje objem prázdného prostoru. Stanovte spektrofotometricky eluční objem pro modrý dextran (Vo pro kolonu) při vlnové délce 280 nm nebo 610 nm změřením objemu výtoku odebraného od místa aplikace vzorku do středu píku výtoku.
Poznámky: Míchání modrého dextranu se standardy soupravy nebo proteiny vzorku se nedoporučuje, protože mnoho proteinů se váže na modrý dextran.
Připravte si bílkovinné standardy a modrý dextran čerstvé.3 Občas se mohou v objemu prázdného místa objevit některé agregované bílkoviny.
- Stanovení objemu eluce (Ve) pro proteinové standardy - Jednotlivé proteinové standardy rozpusťte v ekvilibračním pufru obsahujícím 5 % glycerolu (viz tabulka 1). Pokud po rekonstituci některý z roztoků bílkovin obsahuje nerozpustný materiál, přefiltrujte roztok bílkovin přes 0,45 nebo 0,2 mm filtr. Ztráty bílkovin při této filtraci jsou zanedbatelné. Pro kolonu o rozměrech 90 cm x 1,6 cm dává aplikace 2,0 ml jednotlivých vzorků v doporučené koncentraci (tabulka 2) hodnotu A280 ~1 ve frakci píků.
Následující proteiny lze smíchat a provozovat na kolonách společně:
Cytochrom c a β-amyláza
Karbonická anhydráza a alkoholdehydrogenáza
Aplikujte proteinové standardy na kolonu za použití stejného objemu vzorku a průtoku, jaký byl použit pro vzorek modrého dextranu. Eluci standardních proteinů lze sledovat odečtem absorbance při 280 nm. Stanovte Ve pro proteinové standardy změřením objemu výtoku odebraného od místa aplikace vzorku do středu výtokového píku.
- Standardní křivka - Sestavte graf závislosti molekulové hmotnosti na Ve/Vo pro každý příslušný proteinový standard na semilogovém papíře (obrázek 1).
- Stanovení objemu eluce (Ve) pro neznámý protein - Naneste neznámý vzorek na kolonu o vhodné koncentraci za použití stejného objemu vzorku, velikosti frakce a průtoku, jaké byly použity pro modrý dextran a standardy proteinů. Stanovte Ve neznámého vzorku pomocí stejných metod, které byly použity pro standardy. Vypočítejte Ve/Vo pro neznámou a určete její molekulovou hmotnost ze standardní křivky.
Obrázek 1.Typická kalibrační křivka získaná s proteiny ze sady MWGF200 na Sephacrylu S-200-HR.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?