Purifikace pomocí kolon GST HiTrap^® 1 ml a 5 ml: GSTrap™ 4B, GSTrap™ FF a GSTrap™ HP.

GSTrap afinitní kolony jsou speciálně navržené 1 ml a 5 ml HiTrap kolony s médiem Glutathione Sepharose High Performance, Glutathione Sepharose 4 Fast Flow nebo Glutathione Sepharose 4B. Viz průvodce výběrem v tabulce 3.1 pro možnosti purifikace pomocí těchto kolon a na Characteristics of Glutathione Sepharose and HiTrap Benzamidine FF (high sub) media and columns pro shrnutí jejich vlastností.

Nanášení, promývání a eluci vzorku lze provádět pomocí injekční stříkačky s dodaným konektorem, peristaltické pumpy nebo systému pro kapalinovou chromatografii, jako je ÄKTA. Pro snadné rozšíření lze dvě až tři kolony propojit do série jednoduše zašroubováním konce jedné kolony do horní části další. Obrázek 1 ukazuje schematické znázornění jednoduchých kroků potřebných pro úspěšné čištění pomocí kolon GSTrap.

Obrázek 1. Jednoduchá purifikace proteinů značených GST pomocí kolony GSTrap.

Kolony GSTrap jsou vyrobeny z polypropylenu, který je biokompatibilní a neinteraguje s biomolekulami. Horní a spodní frita jsou vyrobeny z porézního polyethylenu. Kolony se dodávají se zátkou na vstupu a s odcvakávacím koncem na výstupu. Každé balení obsahuje všechny potřebné součásti pro připojení kolon k různým typům zařízení. Upozorňujeme, že kolony GSTrap nelze otevřít ani znovu naplnit.

Kolony GSTrap jsou přímo kompatibilní se stávajícími purifikačními protokoly pro proteiny značené GST, včetně metod proteolytického štěpení na koloně. Pokud je vyžadováno odstranění části GST, lze značený protein štěpit vhodnou proteázou specifickou pro dané místo, dokud je navázán na médium, nebo případně po eluci.

Jedno z médií GST, glutathionová sefaroza 4 Fast Flow, je k dispozici také v předbalených 20ml kolonách GSTPrep FF 16/10. Všechna tři média GST jsou k dispozici ve velkoobjemových baleních (od 10 do 500 ml) pro balení do prázdné kolony podle výběru uživatele.

Chromatografická média jsou velmi stabilní a proces purifikace velmi reprodukovatelný. To je patrné z výsledků experimentu, při kterém byly E. coli homogenáty obsahující GST-hippokalcin (M_r 43 000) opakovaně desetkrát purifikovány na stejné koloně bez čištění mezi jednotlivými běhy (obrázek 2). Deset překrytých chromatogramů ukazuje téměř dokonalou shodu, s malými nebo žádnými odchylkami ve vazebné kapacitě a ukazuje na stabilitu média. Analýza SDS-PAGE (obrázek 2) nepotvrdila žádné změny čistoty nebo vazebné kapacity po těchto 10 bězích.

Obrázek 2. (A) Potvrzení stability glutathionové sepharosy High Performance zabalené do 1 ml kolon GSTrap HP. Chromatografické překrytí 10 opakovaných purifikací. (B) Koomassie barvený neredukovaný SDS-polyakrylamidový gel (ExcelGel SDS Gradient 8-18 %) sdružených frakcí z opakovaných purifikací uvedených v bodě (A).

Před zahájením postupu si přečtěte obecné úvahy pro purifikaci proteinů značených GST.

Potřebná činidla

Do vazebného a elučního pufru lze přidat 1 až 20 mM DTT, aby se snížilo riziko oxidace volných -SH skupin na GST, což může způsobit agregaci značeného cílového proteinu, což vede k nižšímu výtěžku GST značeného proteinu.

Vazný pufr:	PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.3)
Eluční pufr:	50 mM Tris-HCl, 10 mM redukovaného glutathionu, pH 8.0

Postup

1. Naplňte stříkačku nebo hadičku pumpy vazebným pufrem. Odstraňte zátku a připojte kolonu ke stříkačce (použijte dodaný konektor), laboratorní pumpě nebo chromatografickému systému "po kapkách", abyste zabránili vniknutí vzduchu do kolony.
   
   
2. Odstraňte zacvakávací konec na výstupu kolony.
   
   
3. Kolonu ekvilibrujte 5 objemy vazebného pufru.
   
   
4. Předem připravený vzorek aplikujte pomocí injekční stříkačky nasazené na konektor Luer nebo pumpováním na kolonu. Pro dosažení nejlepších výsledků použijte při aplikaci vzorku průtok 0,2 až 1 ml/min (kolona o objemu 1 ml) a 0,5 až 5 ml/min (kolona o objemu 5 ml)¹.
   
   
5. Propláchněte 5 až 10 objemy vazebného pufru na koloně nebo dokud se ve výtoku neobjeví žádný materiál. Při promývání udržujte průtok 1 až 2 ml/min (kolona o objemu 1 ml) a 5 až 10 ml/min (kolona o objemu 5 ml)

Volitelné: Sbírejte průtok (ve frakcích o objemu 1 ml u kolony o objemu 1 ml a ve frakcích o objemu 2 ml u kolony o objemu 5 ml) a rezervujte jej až do úspěšného dokončení postupu. Ponechte si vzorek pro analýzu pomocí SDS-PAGE nebo testu CDNB, abyste zkontrolovali případnou ztrátu nenavázaného cílového proteinu.

1. Eluujte 5 až 10 objemů elučního pufru na koloně. Pro eluci udržujte průtok 0,2 až 1 ml/min (kolona o objemu 1 ml) a 0,5 až 5 ml/min (kolona o objemu 5 ml).
   
   
2. Po eluci regenerujte kolonu promytím 3 až 5 objemy vazebného pufru. Kolona je nyní připravena k nové purifikaci.

¹ Jeden ml/min odpovídá přibližně 30 kapkám/min při použití stříkačky s kolonou HiTrap 1 ml a 5 ml/min odpovídá přibližně 120 kapkám/min při použití kolony HiTrap 5 ml.

Obrázek 3. Použití kolony GSTrap s injekční stříkačkou. A) Připravte pufry a vzorek. Odstraňte horní uzávěr kolony a odlomte její konec. B) Vložte vzorek a začněte sbírat frakce. C) Promyjte a eluujte a pokračujte ve sběru frakcí.

Objem a doba eluce se mohou u jednotlivých značených proteinů lišit. Mohou být nutné další eluce s vyššími koncentracemi glutathionu. Průtok, promývání a eluovaný materiál z kolony je třeba sledovat na přítomnost proteinů značených GST pomocí SDS-PAGE v kombinaci s případným Western blottingem.

Rychlost průtoku ovlivní vazbu a eluci proteinů značených GST na chromatografické médium. Vzhledem k relativně pomalé kinetice vazby mezi GST a glutathionem je důležité udržovat nízkou průtokovou rychlost pro dosažení maximální vazebné kapacity. Dalšími faktory, které mohou ovlivnit vazebnou kapacitu, jsou vlastnosti proteinu, pH a teplota. Při práci s citlivými proteiny se však doporučují vyšší průtokové rychlosti, aby se minimalizovala doba purifikace. Kombinací dvou nebo tří kolon v tandemu by se prodloužila doba setrvání vzorku procházejícího kolonou, což by umožnilo použití vyšších průtokových rychlostí.

Opětné použití kolon GSTrap HP, FF nebo 4B závisí na povaze vzorku a mělo by se provádět pouze s identickými vzorky, aby se zabránilo křížové kontaminaci.