Protilátky v praxi: Obecné informace

Výběr a použití
.Titer a koncentrace protilátek
Skladování protilátek a zacházení s nimi

Výběr a použití

Úvahy při výběru protilátky pro použití v experimentu
Po identifikaci cílového antigenu a výběru metody detekce je třeba vybrat jednu nebo více primárních protilátek pro detekci cíle. Pokud je pro váš cíl k dispozici více než jedna potenciální protilátka, lze doporučit provedení klíčových experimentů s použitím více protilátek (viz Publikování s protilátkami). Protilátky vybírejte na základě následujících úvah:

Určete nejlepší aplikaci pro vaši výzkumnou potřebu:

• Ne všechny protilátky budou fungovat v každé aplikaci.
• Určete, zda provádíte kvalitativní nebo kvantitativní test.
• Podívejte se do datového listu nebo na webové stránky dodavatele a zjistěte, zda je protilátka vhodná pro konkrétní aplikaci, jako je imunoblotting, ELISA atd.

Typ testovaného vzorku:

• Exprimuje vaše tkáň nebo buňka konkrétní protein?
• Snažíte se detekovat latentní nebo aktivovaný protein? Například fosfo-specifické protilátky mohou reagovat pouze s aktivovanými fosforylovanými proteiny.
• Pokud má váš protein intracelulární umístění, bude nutné provést buněčnou lýzu.
• Při průtokové cytometrické analýze může být nutné použít protilátku, která rozpoznává povrchové molekuly buněk.
• Pokud má váš protein terciární strukturu a epitop je zastřený, pak je nutné vzorek denaturovat, protože protilátka nativní stav nerozpozná.
• Některé protilátky budou nejlépe fungovat pouze ve zmrazené nebo na nefixované tkáni a jiné budou fungovat v parafínových řezech pouze po procesu získání antigenu.

Druhy, z nichž má být protein detekován:

• Vyberte protilátku, která je vznesena proti sekvenci imunogenu odvozeného od druhu, který vás zajímá.
• Pokud sekvence není odvozena od druhu, který vás zajímá, ověřte, zda bude reagovat s vaším vzorkem. Sekvenci konkrétních proteinů si můžete rychle ověřit v databance proteinových dat: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein.

Druhy, u kterých byla protilátka vypěstována:

• Tato informace bude velmi výhodná při výběru sekundární protilátky. Sekundární protilátka by měla být fylogeneticky co nejdále od druhu, z něhož pochází váš vzorek.

Zkontrolujte validační údaje dostupné na datovém listu nebo na webových stránkách prodejce:

• Podívejte se na validační údaje na datovém listu nebo na webových stránkách prodejce a prozkoumejte kvalitu údajů.
• Zkontrolujte, zda je uvedeno pouze ověření přítomnosti antigenu (ELISA, Western blotting), nebo zda jsou k dispozici i další podrobné údaje.
• Zkontrolujte, jaký typ vzorku byl testován (buněčný lyzát, tkáňový homogenát atd.). Pouhé použití purifikovaného rekombinantního proteinu nemusí poskytnout nejlepší výsledky u skutečných buněčných nebo tkáňových vzorků.

Záruka a podpora:

• Je k dispozici nabídka záruky od prodejce? Může se jednat o vrácení peněz nebo kredit.
• Jaký typ technické podpory je k dispozici? Nejlepší je mít přístup k živé technické podpoře na rozdíl od často kladených otázek na webových stránkách.

Titr a koncentrace protilátky

Vazba protilátky a antigenu závisí na afinitní konstantě, která zase může být ovlivněna teplotou, pH, složením rozpouštědla atd. Různé relativní koncentrace protilátky a antigenu v roztoku mohou také ovlivnit rozsah tvorby komplexu protilátka-antigen.

Koncentrace a titr nejsou ekvivalentní. Koncentrace je celkové množství protilátky obsažené v roztoku. Obvykle pouze určité procento z něj představuje intaktní, aktivní a funkční protilátku s ohledem na její schopnost vázat antigen a určuje její účinnost. Titr je nejvyšší ředění protilátky, které dává v imunoanalýze odpověď. Je to stupeň, na který lze roztok protilátky a séra naředit a stále obsahovat detekovatelné množství protilátky.

Ve většině případů nelze koncentraci antigenu ve vzorku upravit. Proto musí být optimální pracovní koncentrace (ředění) protilátky stanovena empiricky pro daný soubor experimentálních podmínek.

Pro jakýkoli test je optimální titr taková koncentrace (ředění), která poskytuje nejsilnější reakci pro pozitivní testy s minimální reakcí pozadí (např. pro negativní kontroly). Optimální koncentrace protilátky musí být pro každou zkoušku stanovena experimentálně a obvykle se určuje pomocí řady ředění.

Optimální koncentraci protilátky nejlépe určíte tak, že nejprve zvolíte pevnou dobu inkubace a připravíte řadu ředění k testování. Ředění se obvykle vyjadřují jako poměr koncentrovanějšího základního roztoku k celkovému objemu požadovaného roztoku. Například ředění protilátky v poměru 1:10 vznikne smícháním jednoho dílu základního roztoku protilátky s devíti díly ředicího roztoku, což dává celkem deset dílů.

Datové listy a protokoly mohou navrhovat přibližná ředění pro použití protilátek. Při prvním použití protilátky nebo při práci s novou šarží protilátky se doporučuje vyzkoušet sérii ředění, aby se určilo optimální ředění protilátky, které se má použít. Například pokud je v technickém listu produktu navrženo použití ředění 1:500, provedení ředění 1:50, 1:100, 1:500, 1:1 000 a 1:10 000 může pomoci určit optimální ředění pro sadu jedinečných podmínek testu. Zejména v případě polyklonálních antisér se mohou koncentrace protilátek u jednotlivých zvířat nebo u jednotlivých krvácení ze séra výrazně lišit a tento druh počáteční titrace je nezbytný pro snížení rozdílů mezi jednotlivými testy.

Skladování protilátek a manipulace s nimi

Vhodné skladování protilátek a manipulace s nimi je rozhodující pro jejich funkci a životnost. Správně skladované protilátky vykazují po dlouhou dobu jen malou degradaci, což prodlužuje jejich použitelnost na několik měsíců nebo dokonce let. Nesprávně skladované protilátky mohou naopak denaturovat během několika hodin. Při skladování a manipulaci s protilátkami a dalšími biologickými činidly je třeba vzít v úvahu následující body:

• Pro zachování maximální reaktivity je třeba činidla skladovat podle pokynů výrobce (např, vyhněte se skladování protilátek při pokojové teplotě, pokud je uvedeno skladování při 2-8 °C).
• Je dobrým pravidlem skladovat protilátky v těsně uzavřených nádobách v chladničce/mrazničce bez mrazu, mimo tkáňové fixační prostředky a síťovací činidla.
• Protilátky jsou relativně stabilní proteiny a jsou odolné vůči širokému spektru mírných denaturačních podmínek. Většina protilátek je při správném skladování podle doporučení výrobce stabilní po několik let.
• Ve většině případů lze protilátky skladovat při -20 °C, aniž by došlo ke ztrátě jejich vazebné kapacity.
• Nejlépe je vyhnout se skladování protilátek v mrazničce bez mrazu. To proto, aby se zabránilo cyklům zmrazování a rozmrazování nebo aby se tyto cykly minimalizovaly. Roztoky protilátek by se neměly opakovaně zmrazovat a rozmrazovat, protože to může vést k agregaci, která způsobí ztrátu aktivity. Proto by měly být zásobní roztoky před skladováním alikvotovány.
• Neředěné protilátky by měly být vždy alikvotovány před skladováním při -20 °C, aby se minimalizovaly opakované cykly zmrazování/rozmrazování, které mohou denaturovat protilátky. Skladování protilátek v koncentrované formě zabrání degradaci nebo ji minimalizuje. Do roztoku protilátky lze přidat kryoprotektivum, například glycerol, v konečné koncentraci 50 %, aby se zabránilo poškození při zmrazování/rozmrazování. Protilátky obsahující glycerol neskladujte při teplotě -80 °C. Pokud nebyl přidán stabilizační protein, jako je BSA (1 % w/v), neměly by být protilátky skladovány po delší dobu v pracovních ředěních. Vyvarujte se skladování naředěných protilátek po delší dobu.
• Hlavním problémem, který se vyskytuje během skladování, je kontaminace bakteriemi nebo plísněmi. Pokud jsou protilátky skladovány při teplotě 2-8 °C déle než dva až tři dny, doporučuje se sterilizace filtrem a/nebo přidání bakteriostatika/konzervačního prostředku, jako je 0,05% azid sodný nebo 0,1% thimerosal.
• Azid sodný může interferovat s různými biologickými testy a s některými spojovacími metodami. Proto je v těchto aplikacích nejlepší buď odstranit azid sodný odstředivou diafiltrací, dialýzou nebo gelovou filtrací, nebo použít protilátky bez azidu. Poznámka : Azid sodný je toxický. Stejně jako u všech laboratorních činidel si prostudujte bezpečnostní list materiálu (MSDS), kde jsou uvedena bezpečnostní opatření pro manipulaci s nimi.
• Pravidelně se protilátky konjugované s enzymem nemrazí, aby se zabránilo ztrátě enzymové aktivity a jejich vazebné kapacity. Nejlepší je skladovat je při teplotě +4 °C.
• Fluorescenční konjugáty jsou náchylné k fotoblednutí. Proto by měly být protilátky konjugované s fluorochromem skladovány chráněné před světlem v lahvičce tmavší barvy.
• Při dlouhodobém skladování může u některých roztoků protilátek docházet k tvorbě nerozpustné lipidové složky. Tuto sraženinu lze odstranit rychlou centrifugací při 10 000 g.

Pokračujte v učení o protilátkách s konjugovanými a sekundárními protilátkami