Amplifikace celého transkriptomu RNA ze vzorků s nízkým počtem buněk

Ken Heuermann, Brian Ward

Abstrakt

V této studii byla zkoumána účinnost amplifikace malých množství celkové RNA pomocí Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2) sady pro amplifikaci celého transkriptomu. Celková RNA extrahovaná z klesajícího počtu kmenových buněk kostní dřeně izolovaných metodou FACS (vzorky o 10, 100 a 1000 buňkách) byla amplifikována pomocí soupravy WTA2. U analýzy mikročipů z 10 a 100 buněk byla zjištěna 58,8% míra vyvolání jedinečných biologických znaků, u analýzy mikročipů z 10 a 1000 buněk byla míra vyvolání podobná, a to 61,46 %. Mezi prolínajícími se soubory dat pro obě analýzy existovala více než 90% shoda. Po přísnějším screeningu (p < 0,0001) odhalilo srovnání 10buněčných vs. 100buněčných 5568 protínajících se znaků. Srovnatelná analýza pro 10 buněk vs. 1000 buněk vedla k 4977 znakům, přičemž 3862 znaků bylo společných pro obě srovnání. Dále byl zkoumán vliv snižujícího se vstupu RNA na účinnost amplifikace. Výsledky ukázaly, že úprava koncentrace primerů pro syntézu knihovny umožnila zachovat lineární amplifikaci a reprezentativní qPCR při nízkých vstupních množstvích RNA. Tato úprava se ukázala jako rozhodující pro následné aplikace qPCR, nikoli však pro případ, kdy byl amplifikační produkt použit jako cíl pro microarray. Tato studie potvrzuje, že souprava Complete Whole Transcriptome Amplification Kit dokáže účinně amplifikovat nízká vstupní množství RNA blížící se úrovni jedné buňky.

Úvod

Zvyšuje se zájem o profilování genové exprese ve vzorcích se stále menším počtem buněk. Dosud zůstává zlatým standardem pro současné měření exprese omezeného počtu transkriptů metoda RT-PCR^2, 3. Citlivé globální měření hladin transkriptů lze získat exponenciální amplifikací (na bázi PCR)^4-8 nebo v kombinaci s lineárními metodami⁷. Bylo prokázáno, že sada Complete WTA2, vyvinutá pro zvýšenou amplifikaci poškozené RNA (popsaná v doprovodné posterové prezentaci "Detekce biomarkerů karcinomu prostaty pomocí analýzy expresní mikročipové matrice z RNA amplifikované z FFPE tkání pomocí WTA2"), účinně amplifikuje nízká vstupní množství RNA, blížící se úrovni jedné buňky. RNA izolovaná z pouhých 10 fluorescenčně aktivovaných tříděných buněk (FACS) je amplifikována a zachovává expresní vzorce podobné těm, které byly pozorovány u 10 a 100krát větších buněčných vzorků. Jsou diskutovány výzvy, které jsou jedinečné pro exponenciální amplifikaci malých vstupních množství RNA a které jsou účinně řešeny pro následné aplikace qPCR a microarray.

Materiály a metody

Kmenové buňky izolované z kostní dřeně metodou FACS poskytl Albert Donnenberg z University of Pittsburgh. Buňky byly vytříděny přímo do lyzačního pufru GenElute Mammalian RNA Extraction Kit (RTN70), zmrazeny a uloženy při -70 °C až do extrakce. Celková RNA byla extrahována z 10, 100 a 1000 buněčných vzorků pomocí soupravy GenElute Mammalian RNA Isolation Kit. Vzorek RNA byl eluován ve zmenšeném objemu 40 μl vodou bez nukleázy a podroben zvětšenému (5x) štěpení bez RNázy DNázy (AMP-D1), pro konečný objem 97 μl. Každý vzorek RNA byl amplifikován celý pomocí Complete WTA2 kit (obrázek 1): celý tepelně zeslabený rozklad DNázy byl přímo přidán do doporučeného objemu objemové amplifikační reakce 375 μl, což bylo kompenzováno odečtením objemu vody. V souladu s pokyny k soupravě byl objem 375 μl rozdělen do pěti 75 μl reakcí pro amplifikaci. Každá reakce prošla dvěma cykly až po stacionární amplifikaci ("plateau",  obrázek 2). Neinkorporované primery a další složky reakce byly z amplifikačního produktu odstraněny pomocí sady pro čištění PCR GenElute (NA1020). Kvantitativní PCR (obrázek 3A, B) byla provedena pomocí SYBR^® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (S4438), s koncentrací primerů 250 nM. Páry primerů, s výjimkou sady pro 18S rRNA, jsou specifické pro detekci cDNA.

Amplifikovaná RNA (dvouvláknová cDNA) byla značena pomocí cy3 nebo cy5 podle postupu Agilent Genomic DNA Labeling Kit Plus (5188-5309). Dva amplifikované, diferenciálně značené cíle cDNA byly spojeny, tepelně denaturovány, aplikovány na matrice Agilent Whole Genome™ (G4112F) a inkubovány při 65˚C po dobu 40 hodin. Byly dodrženy postupy hybridizace a následného promývání pro Agilent Oligonucleotide Array-Based CGH for Genomic DNA Analysis, s výjimkou vynechání bloku COT-1 DNA během hybridizace. Matrice byly naskenovány (skener Agilent model G2505B) a extrahovány rysy. Intenzity představující nejednotné rysy nebo spojené s lokálním nejednotným pozadím, kromě "nepřítomných" a nasycených intenzit rysů pole, byly odstraněny pomocí aplikace Microsoft Excel™. Všechny intenzity menší než 100 byly odstraněny, kromě případů, kdy je to uvedeno. Intenzity byly poté podrobeny mediánové normalizaci, Welchovu t-testu, Benjamimiho-Hochbergově korekci míry falešného objevu a ± 1,5násobnému rozdílovému prahu pomocí párového srovnání Genesifter, s výjimkou případů, kdy byla provedena pouze mediánová normalizace, jak je uvedeno. Intenzity pouze normalizované a intenzity podrobené párové analýze Genesifter™ (Geospiza) byly dále analyzovány pomocí softwaru Genesifter Intersector a Spotfire™ (TIBCO), kde je to uvedeno.

Pro studium vlivu snížené koncentrace primerů pro syntézu knihovny na amplifikaci klesajícího množství vstupní RNA byly pomocí qPCR v reálném čase vyhodnoceny hladiny mRNA pro transkripty s vysokou a střední kopií v amplifikačních produktech a "problematický" transkript s nízkou kopií. Příprava snížených koncentrací primerů pro syntézu knihovny byla provedena ředěním roztoku pro syntézu knihovny soupravy (č. součásti L9293) s 5 mM dNTP (dvojnásobné vodné ředění 10 mM dNTP, (D7295).

Obrázek 1. Metodika WTA¹. Celková RNA je kombinována s roztokem pro syntézu knihoven a tepelně denaturována. Poté se přidá reakční pufr a enzym pro syntézu knihovny, který rozděluje vlákna, pro "jednozkumavkovou" reverzní transkripci a syntézu druhého řetězce cDNA (knihovna Omniplex™). 3' konec primeru pro syntézu knihovny je "kvazi-náhodný" a v podstatě nesamostatný, zatímco 5' konec je jediná konstantní nesamostatná sekvence, která slouží jako místo žíhání pro univerzální amplifikační primer.

Výsledky a diskuse

Amplifikace buněčné RNA. Celková RNA byla extrahována z kmenových buněk lidské kostní dřeně izolovaných metodou FACS, jak je popsáno v části Materiály a metody. Amplifikace u všech vzorků proběhla ve dvou cyklech "plateau" neboli stacionární amplifikace (obrázky 1 a 2). Amplifikační produkt byl vyhodnocen pomocí qPCR (obrázek 3A, B) a elektroforézy v agarózovém gelu před analýzou mikročipů (obrázek 3C).

Obrázek 2. Amplifikační profily RNA. Celková RNA byla extrahována ze vzorků buněk podle popisu v části Materiály a metody. Amplifikace RNA byla ponechána v průběhu 2 cyklů stacionární amplifikace (pozorováno pomocí PCR v reálném čase s použitím barviva SybrGreen). Reakce s tisíci buňkami byly zastaveny při 19 cyklech; vzorky se 100 a 10 buňkami při 23 cyklech.

Obrázek 3. Kvalitativní zkouška zesílení. Před analýzou mikročipů byly produkty amplifikační reakce vyhodnoceny pomocí qPCR v reálném čase s použitím párů primerů pro transkripty 18S, GAPDH a β-aktin (A, B). qPCR amplikony byly dále zkontrolovány pomocí 1% agarózové elektroforézy (C).

Mikročipová analýza celobuněčných vzorků. Mezi třemi vzorky kmenových buněk je pozorována silná shoda při detekci znaků mikročipů, v tomto případě normalizovaných intenzit (> 100) (obrázek 4). Více než 85 % znaků detekovaných ve vzorku 10 buněk je detekováno také u vzorku 100 buněk, zatímco > 90 % znaků 10 buněk je detekováno také u vzorku 1000 buněk. Vezmeme-li v úvahu celkový počet 41 000 jedinečných biologických sond na matrici Agilent 4 x 4, detekované rysy pro porovnání 10buněčného a 100buněčného vzorku tvořily 59 % všech rysů matrice, přičemž 48 % rysů matrice bylo sdíleno mezi soubory dat. Podobně pro porovnání 10buněčných a 1000buněčných vzorků bylo detekováno 61 % z celkového počtu rysů pole, přičemž 52 % rysů bylo sdíleno .

Zjištěné vlastnosti souřadnicového systému
Normalizovaný medián
Intenzity > 100

Obrázek 4. Analýza souřadnicového systému odhalila silnou shodu mezi vzorky buněk. Překrývající se oblasti představují medián-normalizované intenzity (> 100). Více než 85 % detekovaných znaků zastoupených v 10buněčném vzorku je detekováno i u 100buněčného vzorku, zatímco > 90 % 10buněčných znaků je detekováno i u 1000buněčného vzorku. Kromě toho jsou překrývající se oblasti vysoce shodné, přičemž více než 98 % překrývajících se intenzit 10/100 buněk je detekováno v průsečíku 10/1000 buněk.

Použití statistických testů poskytuje další důvěryhodnost normalizovaných dat (obrázek 5). Převaha padesáti pěti tisíc rysů byla společná pro vzorky s 10 a 100 buňkami při p < 0,0001. (Tato přísnost odráží analýzu n = 4 pro každý datový bod.) Navíc 70 % rysů společných pro obě datové sady (porovnání 10 buněk/100 buněk) bylo zjištěno také v průniku 10 buněk/1000 buněk. Předpokládá se, že metoda amplifikace WTA2 je dostatečně citlivá k detekci bazální exprese. Takový vysoce stochastický signál(9) je však eliminován replikací a přísným statickým testováním.

Detekované prvky soustavy
Normalizovaný medián
Intenzity >100
p<0,0001

Obrázek 5. Po přísné statistické analýze a korekcích dat uvedených na obrázku 3 (viz Materiály a metody) byl zjištěn značný počet statisticky významných mikročipů (>5500), přičemž shoda mezi oběma překrývajícími se oblastmi souborů dat buněčných vzorků byla zachována. Sedmdesát procent překrývajících se intenzit 10 buněk/100 buněk je detekováno v průsečíku 10 buněk/1000 buněk.

Vliv koncentrace primerů pro syntézu knihovny na následnou aplikaci qPCR. Byla vyslovena hypotéza, že relativně vysoká koncentrace primerů LS může vést k nadměrnému nasycení, což má za následek zkrácení amplifikačního produktu obtížně detekovatelného pomocí qPCR. K ověření této myšlenky bylo snižování vstupního množství lidské prostatické RNA sladěno s podobně klesající koncentrací LS primeru během kroku syntézy knihovny. Sériová ředění vstupní RNA se pohybovala od 25 ng do 12,2 pg a koncentrace LS od 1X koncentrace kitu do 0,0078X. Při použití 1X koncentrace LS primeru při vstupním množství RNA menším než ~800 pg došlo k výrazné ztrátě linearity účinnosti amplifikace (obrázek 6A). Linearita účinnosti se vrací při nižších vstupních množstvích RNA, když se koncentrace 1X LS primeru snižuje o dvojnásobek (obrázek 6B-D). Výsledky kvantitativní PCR s použitím sad primerů pro transkripty TMCC2 s vysokým (18S rRNA), středním (beta-aktin, GAPDH) a nízkým počtem kopií potvrzují tato pozorování (obrázek 7A-D). Zajímavé je, že TMCC2, indikující pouze signál pozadí pro střední vstupní množství RNA, při 1násobné koncentraci LS primeru, zatímco amplifikační produkt je detekován pro všechna vstupní množství RNA při 8násobném ředění LS primeru, což naznačuje, že 8násobné ředění WTA2 LS primeru je optimální pro TMCC2 pro následnou qPCR.

Obrázek 6. Byl zkoumán vliv koncentrace primeru pro syntézu knihovny na amplifikaci malých množství vstupní RNA. Dvojnásobná sériová ředění celkové RNA lidské prostaty poskytla pro reakci vstupní množství v rozmezí od 25 ng do 12,2 pg. Dále byly hodnoceny klesající koncentrace primeru pro syntézu knihovny: 1X koncentrace soupravy WTA2 a tři další dvojnásobná sériová ředění. Hodnoty C(t) naměřené na počátku exponenciálního růstu (práh, 0,025) pro každou amplifikační reakci jsou vyneseny do grafu v závislosti na vstupním množství RNA pro každou testovanou koncentraci primeru pro syntézu knihovny. Jsou zobrazeny výsledky pro koncentraci primeru ze soupravy (1X) a 2násobné, 4násobné a 8násobné ředění primeru. Tyto výsledky naznačují, že vstupní množství RNA menší než ~800 pg. není účinně amplifikováno v přítomnosti 1X koncentrace primeru pro syntézu knihovny. Střední koncentrace primerů (0,5X a 0,25X) vykazují rostoucí zlepšení účinnosti amplifikace. Zdá se, že celková účinnost je zachována při použití 8násobného ředění primeru pro syntézu knihovny.

Obrázek 7. Produkty amplifikace byly podrobeny hodnocení qPCR s použitím sad primerů pro 18S rRNA (A), β-aktin (B), GAPDH (C) a TMCC2 (D). Vložky ukazují křivky tání pro amplifikační produkt při klesajícím množství vstupní RNA reakce a pro 1X a 0,125X koncentraci primerů. A - C představují transkripty rRNA s vysokým počtem kopií a transkripty se středním počtem kopií a domácí transkripty; u TMCC2, lidského transkriptu rodiny 2 s transmembránovou doménou a doménou vinutého závitu, bylo v předchozích studiích zjištěno, že je nekonzistentně detekovatelný, s C(t)s v polovině 30. let. Zajímavé je, že u 18S rRNA je pozorován vzorec dvoufázové neúčinné amplifikace při nejvyšších a nejnižších vstupních množstvích pro obě koncentrace primerů pro syntézu knihovny. Pro β-aktin a GAPDH jsou pozorovány obecně konzistentní hodnoty C(t) při 0,125násobné koncentraci primeru, zatímco při 1násobné koncentraci primeru je pozorován postupný pokles účinnosti s klesajícím vstupním množstvím. Při 1násobné koncentraci primeru není pro TMCC2 zjištěn žádný amplifikační produkt. Pozorován je pouze falešný signál při 75 stupních (primer-dimer, údaje z gelu nejsou uvedeny). Při nízké koncentraci primeru pro syntézu knihovny je však amplikon TMCC2 detekovatelný při všech vstupních množstvích.

Vliv koncentrace primeru pro syntézu knihovny na následné analýzy mikročipů
Aby se zjistilo, zda je použití snížené koncentrace primeru LS vhodné pro analýzu mikročipů při nízkých vstupních množstvích RNA, byl testován produkt amplifikace ze tří vstupních množství (obrázek 8): 6,25 ng (přibližně množství doporučené soupravou na 75 μl reakce)¹, 391 pg (těsně pod hranicí 800 pg pozorovanou na obrázku 6A)² a 48 pg.8 pg (přibližný hmotnostní ekvivalent pro "jedinou" buňku).³ Produkty amplifikace byly označeny a podrobeny mikročásticovým analýzám, jak je popsáno v části Materiály a metody. Na obrázku 8A (nenormalizované intenzity) je znázorněna reprodukovatelnost mezi duplikáty se stejným barvivem pro testovaná vstupní množství. Obrázek 8B (rovněž nenormalizované intenzity) ukazuje křížové srovnání vstupních duplikátů (n = 4). Pro každé srovnání je pozorován předvídatelný nárůst rozptylu pro 1násobnou koncentraci primeru LS (viz diskuse). Kvantitativní a kvalitativní shoda mezi duplikáty vytvořenými s 8násobným ředěním primeru LS je však podstatně menší. Toto pozorování se rozšiřuje i na obrázek 8C, kde byly soubory dat statisticky analyzovány (t-test, korekce míry falešných objevů a prahová hodnota ± 1,5). Koncentrace primeru pro syntézu knihovny 1X se pro analýzu mikročipů osvědčuje nesporně lépe.

Obrázek 8. Amplifikační produkt vytvořený ze vstupních množství 6,25 ng, 390 pg nebo 48 pg, připravený s primerem pro syntézu knihovny 1X nebo 0,125X, byl označen pro analýzu mikročipů podle popisu v části Materiály a metody. Výsledky jsou uvedeny v panelech A až C (logaritmické intenzity vs. log2 intenzity). Panel A ukazuje reprodukovatelnost pro duplicitní reakce o velikosti 6,25 ng (1), reakce o velikosti 390 pg (2) a reakce o velikosti 50 pg (3). V panelu B jsou vyneseny intenzity reakcí 6,25 ng versus intenzity reakcí 390 pg (1), intenzity reakcí 6,25 ng versus intenzity reakcí 48 pg (2) a intenzity reakcí 390 pg versus intenzity reakcí 48 pg (3). Statisticky analyzované a normalizované intenzity jsou uvedeny v panelu C: reakční intenzity 6,25 ng versus reakční intenzity 390 pg (1), reakční intenzity 6,25 ng versus reakční intenzity 48 pg (2) a reakční intenzity 390 pg versus reakční intenzity 48 pg (3). Pozitivní účinek snížené koncentrace primerů pro syntézu knihovny pozorovaný u kvantitativní PCR není u výsledků mikroarray patrný.

Závěry

Tato pozorování naznačují, že snížení koncentrace primerů pro syntézu knihovny zvyšuje detekci transkriptů s nízkým počtem kopií při provádění downsteam qPCR

aplikace. Při 1násobné koncentraci primeru LS lze spolehlivě detekovat transkripty se střední kopií (obrázek 7B, C). Transkripty s nízkou kopií však mohou být nadměrně kopírovány, což vede k tomu, že templát je příliš krátký na to, aby oba qPCR primery sady našly svá příslušná místa žíhání (obrázek 7D). To se nezdá být problémem pro analýzu na mikročipech (obrázek 8), kde by zmenšení velikosti amplifikačního produktu bylo v podstatě ekvivalentní fragmentaci cíle. Snížená koncentrace primeru však snižuje pravděpodobnost, že LS primer najde všechny potenciální templáty, a brání tak rovnoměrné amplifikaci transkriptomu. To však neznamená, že výsledky analýzy na mikročipu nejsou ovlivněny vyšší koncentrací LS primeru. Tento efekt se projevuje předvídatelně malým zvýšením diferencí exprese u transkriptů s nízkou kopií a podobně malou kompresí diferencí spojených s transkripty s vysokou kopií. Obojí lze zvládnout pomocí jednoduchých škálovacích algoritmů¹⁰. Proto je snížená koncentrace primerů pro syntézu knihovny optimální pro detekci transkriptů s nízkou kopií pomocí qPCR a standardní koncentrace soupravy se používá pro reprezentativní amplifikaci pro všechna vstupní množství RNA při následné analýze na mikročipu.

(Pro zkoušejícího, který využívá amplifikační produkt WTA2 pro případné studie qPCR, se doporučuje testovat sériová ředění primeru LS, aby se našla koncentrace optimální pro detekci vybraných transkriptů, jak je ukázáno v této prezentaci. Pokyny pro ředění LS primeru jsou uvedeny v Materiálech a metodách.)

Závěrem lze říci, že sada Complete WTA2 kit poskytuje robustní a citlivou metodu pro amplifikaci množství RNA blížícího se úrovni jedné buňky při zachování reprezentativního vzorce exprese vyššího množství vstupní RNA.

Poděkování:

Děkujeme Albertu Donnenbergovi z University of Pittsburgh za poskytnutí kmenových buněk kostní dřeně pro tuto studii.

Odkazy

1. Kamberov E. et al. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process. US Patent Application 2007054311, 3/8/2007. (Previously, US Patent Application 20040209298, 12/14/2005.) EPO Application EP1604040, 12/14/2005. WIPO PCT WO2004081225, 9/23/2004).. [dissertation].

2. Dahari H, Sainz B, Perelson AS, Uprichard SL. 2009. Modeling Subgenomic Hepatitis C Virus RNA Kinetics during Treatment with Alpha Interferon. JVI. 83(13):6383-6390. https://doi.org/10.1128/jvi.02612-08

3. Merens A, Guerin PJ, Guthmann J, Nicand E. 2009. Outbreak of Hepatitis E Virus Infection in Darfur, Sudan: Effectiveness of Real-Time Reverse Transcription-PCR Analysis of Dried Blood Spots. Journal of Clinical Microbiology. 47(6):1931-1933. https://doi.org/10.1128/jcm.02245-08

4. Iscove NN, Barbara M, Gu M, Gibson M, Modi C, Winegarden N. 2002. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat Biotechnol. 20(9):940-943. https://doi.org/10.1038/nbt729

5. Li Y, Ali S, Philip PA, Sarkar FH. 2003. Direct comparison of microarray gene expression profiles between non-amplification and a modified cDNA amplification procedure applicable for needle biopsy tissues. Cancer Detection and Prevention. 27(5):405-411. https://doi.org/10.1016/s0361-090x(03)00105-3

6. Bystrova MF, Romanov RA, Rogachevskaja OA, Churbanov GD, Kolesnikov SS. 2010. Functional expression of the extracellular-Ca 2+ -sensing receptor in mouse taste cells. J Cell Sci. 123(6):972-982. https://doi.org/10.1242/jcs.061879

7. Lang JE, Magbanua M, Scott JH, Makrigiorgos GM, Wang G, Federman S, Esserman LJ, Park JW, Haqq CM. 2009. A comparison of RNA amplification techniques at sub-nanogram input concentration. BMC Genomics. 10(1):326. https://doi.org/10.1186/1471-2164-10-326

8. Kurimoto K. 2006. An improved single-cell cDNA amplification method for efficient high-density oligonucleotide microarray analysis. Nucleic Acids Research. 34(5):e42-e42. https://doi.org/10.1093/nar/gkl050

9. Nygaard V. 2006. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Research. 34(3):996-1014. https://doi.org/10.1093/nar/gkj499

10. Basic Data Analysis.17-32. https://doi.org/10.1002/0471227587.ch3