Příprava vzorku pro velikostní vylučovací chromatografii

Vzorky pro chromatografické čištění by měly být čiré a bez pevných částic. Jednoduché kroky k vyčištění vzorku před zahájením purifikace zabrání ucpání kolony, mohou snížit potřebu přísných promývacích postupů a mohou prodloužit životnost chromatografického média.

Postupy extrakce vzorku a výběr pufrů, aditiv a detergentů jsou do značné míry určeny zdrojem materiálu, stabilitou cílové molekuly, chromatografickými technikami, které budou použity, a zamýšleným použitím produktu. Těmito tématy se obecně zabývá Příručka pro čištění proteinů a konkrétněji podle cílové molekuly Příručka pro rekombinantní proteiny a Příručka pro čištění protilátek, které jsou k dispozici u společnosti Cytiva.

Čištění vzorků

Centrifugace a filtrace jsou standardní laboratorní techniky pro čištění vzorků a používají se běžně při manipulaci s malými vzorky.

Důrazně se doporučuje odstředit a filtrovat jakýkoli vzorek bezprostředně před chromatografickým čištěním.

Centrifugace

Centrifugací se odstraní lipidy a pevné částice, například zbytky buněk. Pokud není vzorek po odstředění stále čirý, použijte jako první stupeň filtrační papír nebo 5 μm filtr a jako druhý stupeň jeden z níže uvedených filtrů.

• U malých objemů vzorků nebo proteinů, které se adsorbují na filtry, odstřeďujte 15 min při 10 000 × g.
• U buněčných lyzátů odstřeďujte 30 min při 40 000 až 50 000 × g.
• U buněčných lyzátů odstřeďujte 30 min při 40 000 až 50 000 × g.
• Vzorky séra lze po odstředění přefiltrovat přes skleněnou vatu, aby se odstranily všechny zbývající lipidy.

Filtrace

Filtrací se odstraní pevné částice. Membránové filtry, které poskytují nejmenší množství nespecifické vazby proteinů, jsou složeny z acetátu celulózy nebo PVDF.

Pro přípravu vzorku před chromatografií zvolte velikost pórů filtru v poměru k velikosti kuliček chromatografického média (Tabulka A3.1).

Tabulka A3.1 Doporučená velikost pórů filtru

Nominální velikost pórů filtru	Velikost částic chromatografického média
1 μm	90 μm a více
0.45 μm	34 μm
0.22 μm	3, 10, 15 μm nebo v případě potřeby extra čistých vzorků nebo sterilní filtrace

Zkontrolujte výtěžnost cílového proteinu v testovacím cyklu. Některé proteiny se mohou nespecificky adsorbovat na povrchy filtrů.

Desalt

Denaturace

.

Tabulka A3.2 Běžná denaturační činidla

Denaturační činidlo	Typické podmínky použití	Odstranění/komentář
Močovina	2 až 6 M	Odstraňte pomocí Sephadexu G-25
Guanidin hydrochlorid	Odstranit pomocí Sephadexu G-25

Podrobnosti převzaty z: Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998) a dalších zdrojů.

Precipitace a resolubilizace

Je-li známo, že surový vzorek obsahuje kontaminanty, jako jsou lipidy, lipoproteiny nebo fenolová červeň, které se mohou na koloně hromadit, mohou být nutné specifické kroky přípravy vzorku. Příprava vzorku může být také nutná, pokud je třeba před jakýmkoli chromatografickým krokem odstranit určité hrubé nečistoty, jako je objemný protein.

Frakční srážení se příležitostně používá v laboratorním měřítku k odstranění hrubých nečistot, ale při purifikaci afinitně značených proteinů se obecně nevyžaduje. V některých případech může být srážení užitečné jako kombinovaný krok koncentrace a purifikace bílkovin.

Srážecí techniky oddělují frakce na principu rozdílné rozpustnosti. Protože se například druhy proteinů liší stupněm hydrofobicity, zvýšená koncentrace soli může posílit hydrofobní interakce mezi proteiny a způsobit precipitaci. Frakční srážení lze použít k odstranění hrubých nečistot třemi různými způsoby, jak ukazuje obrázek A3.1.

Obrázek A3.1. Tři způsoby použití srážek.

Srážecí techniky mohou být ovlivněny teplotou, pH a koncentrací vzorku.

Tyto parametry je třeba kontrolovat, aby byly zajištěny reprodukovatelné výsledky.
Většina srážecích technik není vhodná pro přípravu ve velkém měřítku.

Tabulka A3.3 Příklady technik srážení

Srážedlo	Typické podmínky použití	.Typ vzorku	Komentář
Síran amonný	Jak je popsáno níže.	> 1 mg/ml proteinů, zejména imunoglobulinů.	Stabilizuje proteiny, nedochází k denaturaci; supernatant může jít přímo do HIC. Pomáhá snižovat obsah lipidů.
Dextran sulfát	Přidá se 0.04 ml 10% dextran sulfátu a 1 ml 1 M CaCl2 na 1 ml vzorku, míchat 15 min, odstředit při 10 000 × g, pelet zlikvidovat.	Vzorky s vysokým obsahem lipoproteinů, např, ascites.	Precipituje lipoprotein.
Polyvinylpyrolidin	Přidat 3 % (w/v), míchat 4 h, odstředit při 17 000 × g, vyřadit pelet.	Vzorky s vysokým obsahem lipoproteinů, např, ascites.	Alternativa k dextran sulfátu.
Polyethylenglykol (PEG, Mr > 4000)	Do 20 % (w/v).	Plasmatické proteiny.	Není denaturace, supernatant jde přímo do IEX nebo AC, úplné odstranění může být obtížné. Stabilizuje proteiny.
Aceton (studený)	Do 80 % (v/v) při 0 °C.	Sbírejte pelety po odstředění plnou rychlostí v mikrocentrifuze.	Může ireverzibilně denaturovat bílkoviny. Užitečné pro precipitaci peptidů nebo koncentraci vzorku pro elektroforézu.
Polyethylenimin	0,1 % (w/v).		Precipituje agregované nukleoproteiny.
Protamin sulfát	1% (w/v).		Precipituje agregované nukleoproteiny.
Streptomycin sulfát	1% (w/v).		Precipituje nukleové kyseliny.
Kyselina kaprylová	(X/15) g, kde X = objem vzorku.	Koncentrace protilátek by měla být > 1 mg/ml.	Precipituje většinu bílkovin ze séra nebo ascitu a ponechává imunoglobuliny v roztoku.

Podrobnosti převzaty z: Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998).

Srážení síranem amonným

Srážení síranem amonným se často používá pro počáteční koncentraci a čištění vzorků. Při zvyšování koncentrace soli se začnou "solit" bílkoviny. Různé bílkoviny se solí při různých koncentracích, což je proces, který lze využít k odstranění kontaminujících bílkovin ze surového extraktu. Koncentraci soli je třeba optimalizovat tak, aby se odstranily kontaminující látky, a nikoli požadované bílkoviny. Další krok se zvýšenou koncentrací soli by pak měl vysrážet cílový protein. Pokud cílový protein nelze bezpečně vysrážet a znovu rozpustit, měl by se použít pouze první krok. HIC je často vynikajícím dalším purifikačním krokem, protože vzorek již obsahuje vysokou koncentraci solí a lze jej aplikovat přímo na kolonu HIC bez další přípravy nebo jen s malou přípravou. Zvýšený obsah soli zvyšuje interakci mezi hydrofobními složkami vzorku a chromatografickým médiem.

Roztoky potřebné pro srážení:

• Nasycený roztok síranu amonného (přidejte 100 g síranu amonného do 100 ml destilované vody, promíchejte, aby se rozpustil).
• 1 M Tris-HCl, pH 8,0.
• Pufr pro první purifikační krok.

Některé proteiny mohou být síranem amonným poškozeny. Při přidávání krystalického síranu amonného buďte opatrní: vysoké lokální koncentrace mohou způsobit kontaminaci precipitátu nežádoucími proteiny.

Pro rutinní reprodukovatelné purifikace je třeba se vyhnout precipitaci síranem amonným ve prospěch chromatografie.

Obecně je srážení zřídka účinné pro koncentrace proteinů nižší než 1 mg/ml.

1. Filtr (0.45 μm) nebo vzorek odstřeďte (10 000 × g při 4 °C).
2. Přidejte 1 díl 1 M Tris-HCl, pH 8,0 na 10 dílů objemu vzorku, aby se udrželo pH.
3. Jemně promíchejte. Přidejte roztok síranu amonného po kapkách. Přidávejte až do 50% nasycení*. Míchejte 1 h.
4. Centrifugujte 20 min při 10 000 × g.
5. Odstraňte supernatant. Pelet dvakrát promyjte resuspenzí ve stejném objemu roztoku síranu amonného o stejné koncentraci (tj. roztoku, který znovu nerozpustí vysrážený protein nebo nezpůsobí další srážení). Znovu odstřeďte.
6. Peletu rozpusťte v malém objemu pufru, který bude použit pro další krok.
7. Síran amonný se odstraní během kroků čiření/výměny pufru s přípravkem Sephadex G-25 pomocí odsolovacích kolonek (viz kapitola 5).

*Procento nasycení lze upravit buď tak, aby se vysrážela cílová molekula, nebo aby se vysrážely kontaminanty.

Množství síranu amonného potřebné k dosažení daného stupně nasycení se liší podle teploty. Tabulka A3.4 uvádí množství potřebné při 20 °C.

Tabulka A3.4 Množství síranu amonného potřebné k dosažení daných stupňů nasycení při 20 °C

Konečné procento nasycení, které má být získáno+A1:R23
	20	25	30	35	40	45	<50	55	60	65	70	75	80	85	Přibližná šířka: 28 cm.90	95	100
Začáteční procento	Množství síranu amonného, které se přidá (v gramech) na litr roztoku při 20 °C
0	113	144	176	208		242	277	314	351	390	430	472	516	561	608	657	708	761
5	85	115	146	179	212	246	282	319	358	397	439	481	526	572	621	671	723
10	57	86	117	149	182	216	251	287	325	364	405	447	491	537	584	634	685
15	28	58	88	119	151	185	219	255	293	331	371	413	456	501	548	596	647
20	0	29	59	89	121	154	188	223	260	298	337	378	421	465	511	559	609	609	511
25		0	29	60	91	123	157	191	228	265	304	344	386	429	475	522	571
30			0	30	61	92	125	160	195	232	270	309	351	393	438	485	533
35				0	30	62	94	128	163	199	236	275	316	358	402	447	495
40					0	31	63	96	130	166	202	241	281	322	365	410	457
45						0	31	64	98	132	169	206	245	286	329	373	419
50							0	32	65	99	135	172	210	250	292	335	381
55								0	33	66	101	138	175	215	256	298	343
60									0	33	67	103	140	179	219	261	305
65											0	34	69	105	143	183	224	267
										0	34	70	107	146	186	228
75	<./td>											0	35	72	110	149	190
80													0	36	73	112	152
85															0	37	75	114
90															0	37	76
95																0	38

Odstranění lipoproteinů

Lipoproteiny a další lipidový materiál mohou rychle ucpat chromatografické kolony, proto je vhodné je před zahájením purifikace odstranit. K odstranění vysokého množství lipoproteinů ze vzorků, jako je například tekutina z ascitu, se doporučují srážecí činidla, jako je dextran sulfát a polyvinylpyrolidin, popsaná v části Frakční srážení.

Vzorky odstřeďte, abyste se vyhnuli riziku nespecifické vazby cílové molekuly na filtr.

Vzorky, jako je sérum, lze filtrovat přes skleněnou vatu, aby se odstranily zbývající lipidy.