Purifikační kolony GSTrap™

Kolony GSTrap™ affinity jsou speciálně navržené 1 ml a 5 ml HiTrap kolony s glutathionovou separa- zou^®.High Performance, Glutathione Sepharose^® 4 Fast Flow nebo Glutathione Sepharose^® 4B chromatografickým médiem. Shrnutí jejich rozdílů najdete v průvodci výběrem (tabulka 1), Purification options for GST-tagged proteins using Glutathione Sepharose^® products, a Characteristics of Glutathione Sepharose^® products pro seznam klíčových vlastností každého z nich.

Nanášení, promývání a eluci vzorku lze provádět pomocí injekční stříkačky s dodaným konektorem, peristaltické pumpy nebo systému pro kapalinovou chromatografii, jako je ÄKTA (

Obrázek 1. Kolony GSTrap™ HP, GSTrap™ 4B a GSTrap™ FF o objemu 1 ml a 5 ml umožňují pohodlnou a jednoduchou purifikaci proteinů značených GST v jednom kroku. Jednoduchá purifikace proteinů značených GST je znázorněna vpravo.

Kolony GSTrap™ HP, FF a 4B jsou vyrobeny z polypropylenu, který je biokompatibilní a neinteraguje s biomolekulami. Horní a spodní frita jsou vyrobeny z porézního polyethylenu. Kolony se dodávají se zátkou na vstupu a s odcvakávacím koncem na výstupu. Každé balení obsahuje všechny potřebné součásti pro připojení kolon k různým typům zařízení. Všimněte si, že kolony GSTrap™ nelze otevřít ani refillovat.

Kolony GSTrap™ jsou přímo kompatibilní se stávajícími purifikačními protokoly pro proteiny značené GST, včetně metod proteolytického štěpení na koloně. Pokud je vyžadováno odstranění části GST, lze značený protein štěpit vhodnou site-specifickou proteázou během vazby na médium nebo alternativně po eluci (viz dále v této kapitole). Štěpení na koloně eliminuje další krok separace uvolněného proteinu od GST, protože část GST zůstává navázaná.

Jedno ze tří médií, glutathionová sepharose^® 4 Fast Flow, je k dispozici také v předbalených 20ml kolonách GSTPrep FF 16/10. V případě, že se jedná o kolonu GSTPrep FF 16/10, je možné ji použít i v případě, že je na ní navázán GST. Všechna tři média jsou k dispozici ve velkoobjemových baleních (od 10 do 500 ml) pro balení do kolony podle výběru uživatele.

Informace o čištění, skladování a manipulaci naleznete na Characteristics of Glutathione Sepharose^® products.

Chromatografická média jsou velmi stabilní a purifikační proces velmi reprodukovatelný. To je patrné z výsledků experimentu, při kterém byly E. coli homogenáty obsahující GST-hippokalcin (M_r 43 000) opakovaně purifikovány 10krát na stejné koloně bez čištění mezi jednotlivými cykly. Deset překrytých chromatogramů (obrázek 2A) ukazuje téměř dokonalou shodu, což svědčí o malé nebo žádné variabilitě vazebné kapacity a stability média. Analýza SDS-PAGE (obrázek 2B) rovněž ukazuje.

Obrázek 2. (A) Konfirmace stability glutathionové sepharosy^® High Performance zabalené v 1 ml kolon GSTrap™ HP. Chromatografické překrytí 10 opakovaných purifikací. (B) Neredukovaný SDS-polyakrylamidový gel (ExcelGel SDS Gradient 8-18) barvený Coomassie ze sdružených frakcí z opakovaných purifikačních cyklů uvedených v bodě (A).

Příprava vzorků

Před zahájením tohoto postupu si přečtěte Obecné pokyny pro purifikaci proteinů značených GST.

Přizpůsobte vzorek složení a pH vazebného pufru přídavkem z koncentrovaných zásobních roztoků; zředěním vzorku vazebným pufrem; nebo výměnou pufru.

Propusťte vzorek přes filtr 0,22 µM nebo 0,45 µM a/nebo jej bezprostředně před aplikací vzorku odstřeďte. Pokud je vzorek příliš viskózní, zřeďte jej vazebným pufrem, abyste zabránili jeho ucpání; zvyšte míru lyzačního ošetření (sonikace, homogenizace); nebo přidejte DNázu/RNázu, abyste zmenšili velikost fragmentů nukleové kyseliny.

Příprava pufru

Používejte vysoce čistou vodu a chemikálie a před použitím propusťte všechny pufry přes filtr o koncentraci 0,45 µM.

Vazba pufru: Eluční pufr:

PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7,3 50 mM Tris-HCl, 10 až 20 mM redukovaného glutathionu, pH 8,0

Ve vazebném a elučním pufru může být obsaženo 1 až 20 mM DTT, aby se snížilo riziko oxidace volných -SH skupin na GST, což může způsobit agregaci značeného cílového proteinu, což vede k nižšímu výtěžku značeného proteinu GST.

Purifikace

1. Naplňte stříkačku nebo hadičku pumpy vazebným pufrem. Odstraňte zátku a připojte kolonu ke stříkačce (použijte dodaný konektor), laboratorní pumpě nebo chromatografickému systému "po kapkách", abyste zabránili vniknutí vzduchu do kolony.
2. Odstraňte zacvakávací konec na výstupu kolony.
3. Kolonu ekvilibrujte 5 objemy vazebného pufru.
4. Předem upravený vzorek aplikujte pomocí stříkačky fitrované na konektor Luer nebo pumpováním na kolonu. Pro dosažení nejlepších výsledků použijte při nanášení vzorku¹ rychlost flokování 0,2 až 1 ml/min (kolona o objemu 1 ml) a 0,5 až 5 ml/min (kolona o objemu 5 ml).
5. Promyjte kolonu 5 až 10 objemy vazebného pufru nebo dokud se v effluentu neobjeví žádný materiál. Udržujte rychlost průtoku fluence 1 až 2 ml/min (1 ml kolona) a 5 až 10 ml/min (5 ml kolona) pro promývání.

Volitelné: Shromážděte průtok fluence (ve frakcích o objemu 1 ml pro 1 ml kolonu a ve frakcích o objemu 2 ml pro 5 ml kolonu) a rezervujte jej až do úspěšného dokončení postupu. Ponechte si vzorek pro analýzu pomocí SDS-PAGE nebo testu CDNB, abyste zkontrolovali případnou ztrátu nenavázaného cílového proteinu.

6. Eluujte 5 až 10 objemy elučního pufru na koloně. Při eluci udržujte rychlost proudění 0,2 až 1 ml/min (kolona o objemu 1 ml) a 0,5 až 5 ml/min (kolona o objemu 5 ml).
7. Po eluci regenerujte kolonu promytím 3 až 5 objemy vazebného pufru. Kolona je nyní připravena k nové purifikaci.

¹ Jeden ml/min odpovídá přibližně 30 kapkám/min při použití stříkačky s kolonou HiTrap 1 ml a 5 ml/min odpovídá přibližně 120 kapkám/min při použití kolony HiTrap 5 ml.

Obrázek 3. Použití kolony GSTrap™ s injekční stříkačkou. A) Připravte pufry a vzorek. Odstraňte horní uzávěr kolony a odlomte její konec. B) Vložte vzorek a začněte sbírat frakce. C) Promyjte a eluujte a pokračujte ve sběru frakcí.

Objem a doba eluce se mohou u jednotlivých značených proteinů lišit. Mohou být nutné další eluce s vyššími koncentracemi glutathionu. Průtok, promývání a eluovaný materiál z kolony je třeba sledovat na přítomnost proteinů značených GST pomocí SDS-PAGE v kombinaci s případným Western blottingem.

Rychlost průtoku ovlivní vazbu a eluci proteinů značených GST na chromatografické médium. Vzhledem k relativně pomalé kinetice vazby mezi GST a glutathionem je pro dosažení maximální vazebné kapacity důležité udržovat nízkou rychlost flow. Vlastnosti proteinu, pH a teplota jsou dalšími faktory, které mohou ovlivnit vazebnou kapacitu. Při práci s citlivými proteiny se však doporučují vyšší rychlosti flow, aby se minimalizovala doba purifikace. Kombinací dvou nebo tří kolon v tandemu by se prodloužila doba zdržení vzorku procházejícího kolonou, což by umožnilo použít vyšší rychlosti flow.

Pětovné použití kolon GSTrap™ HP, FF nebo 4B závisí na povaze vzorku a mělo by se provádět pouze s identickými vzorky, aby se zabránilo křížové kontaminaci.

Příklady použití

1. Vysoce účinná purifikace GST-hippokalcinu pomocí kolon GSTrap™ HP o objemu 1 ml a 5 ml

Glutathionová sepharose^® High Performance se snadno používá pro jednostupňovou purifikaci proteinů značených GST. Následující údaje ukazují výsledky z experimentů s použitím jak GSTrap™ HP 1 ml, tak 5 ml.

V této studii bylo použito 5 ml a 25 ml E. coli homogenátu obsahujícího GST-hippokalcin byly naloženy na kolony GSTrap™ HP 1 mL a 5 mL. Obrázek 4A-B ukazuje chromatogramy z obou běhů. Množství proteinu v eluovaných vrcholech bylo vypočteno jako 6,5 mg, resp. 39,7 mg.

Analýza SDS-PAGE ukázala, že GST-hippokalcin byl analyzován za podmínek neredukujícího a redukujícího pufru (Obr. 4C). Každá jamka byla zatížena 10 µg proteinu. Analýza SDS-PAGE rovněž ukázala, že byl exprimován volný GST. Přítomnost redukčního činidla vedla k odstranění vysokomolekulárních pásů, které mohou odpovídat proteinu s označením GST, který se asocioval oxidací volných sulfhydrylových skupin.

Obrázek 4. Rozšíření z (A) GSTrap™ HP 1 ml na (B) GSTrap™ HP 5 ml. (C) Redukovaný a neredukovaný SDS-polyakrylamidový gel (ExcelGel SDS Gradient 8-18) s barvením Coomassie frakcí z purifikace.

2. Rychlá purifikace proteinu značeného GST pomocí kolon GSTrap™ FF 1 ml a 5 ml

Protein značený GST byl purifikován z 8 ml a 40 ml klarifikovaného buněčného lyzátu pomocí kolon GSTrap™ FF 1 ml a 5 ml. Vzorky byly naneseny na kolony předem ekvilibrované PBS (pH 7,3). Po promytí kolon 10 objemy PBS byl protein značený GST eluován pomocí redukovaného glutathionu (obrázek 5). Každý cyklus byl dokončen za 25 minut. Analýza pomocí SDS-PAGE ukázala izolaci vysoce čistého proteinu značeného GST (není uvedeno). Výtěžek značených proteinů byl 2,7 mg z GSTrap™ FF 1 ml a 13,4 mg z GSTrap™ FF 5 ml.

Obrázek 5. Purifikace proteinu značeného GST na kolonách GSTrap™ FF o objemu 1 ml a 5 ml. Cytoplazmatický extrakt (8 a 40 ml) z E. coli exprimující protein značený GST byl aplikován na GSTrap™ FF 1 ml (A), respektive GSTrap™ FF 5 ml (B).

3. Dvoustupňová automatizovaná purifikace pomocí ÄKTAxpress

Dvoustupňová automatizovaná purifikace GST-hippokalcinu z klarifikovaného lyzátu E. coli byla provedena na ÄKTAxpress. V prvním kroku zachycení AC byla použita kolona GSTrap™ 4B o objemu 1 ml a v kroku leštění SEC kolona HiLoad 16/60 Superdex 200 pg.

Redukční činidlo (DTT) bylo obsaženo ve vzorku i v pufrech. ÄKTAxpress umožnil automatické načítání eluovaných frakcí cílového proteinu z kroku zachycení (GSTrap™ 4B) na kolonu SEC. Lýza E. coli  obsahující GST-hippokalcin byla provedena enzymaticky s následnou sonikací. Lyzát byl odstředěním a filtrací vyklírován a 5 ml vyklírovaného lyzátu bylo vloženo na 1 ml kolony GSTrap™ 4B. Chromatogramy z automatizované dvoustupňové purifikace a SDS-PAGE eluovaného poolu cílového proteinu jsou uvedeny na obrázku 6. Po SEC byly získány dva píky: jeden malý a jeden velký. Malý pík byly pravděpodobně agregáty a velký pík se zdál být dimery GST-hippokalcinu. Vyhodnocení pomocí SDS-PAGE ukázalo, že oba píky obsahují GST-hippokalcin.  Čistota GST-hippokalcinu v hlavní frakci byla dobrá (obrázek 6C).

Výtěžek eluovaného GST-hippokalcinu, stanovený pomocí absorbance při 280 nm s použitím softwaru UNICORN, byl 6,4 mg.

Tato aplikace ukazuje výhodnost použití dvoustupňové purifikace pro zvýšení čistoty GST-hippokalcinu.

Obrázek 6. (A) Purifikace GST-hippokalcinu z lyzátu E. coli pomocí automatizované dvoustupňové purifikace na ÄKTAxpressu. (B) Zvětšení píku z kroku SEC odhalilo velké agregáty a dimery purifikovaného GST-hippokalcinu. (C) SDS-PAGE (ExcelGel SDS Gradient 8-18 %) ukazující finální čistotu GST-hippokalcinu (pruh 4).