Provedení purifikace protilátek IgG pomocí zařízení Protein G HP SpinTrap™/Ab SpinTrap™

Protein G HP SpinTrap™ jsou předbalené spinové kolony na jedno použití pro obohacování proteinů cílových antigenů z komplexů monoklonálních a polyklonálních protilátek z neklonovaného séra a supernatantů buněčných kultur (obrázek 3.7). Kromě toho jsou kolony navrženy pro purifikaci více vzorků v malém měřítku paralelně a jsou vhodné pro použití ve screeningových experimentech s protilátkami. Kolonka Protein G HP SpinTrap™ obsahuje separaózu Protein G^® High Performance, která má vysokou kapacitu vazby proteinů a je kompatibilní se všemi pufry běžně používanými při purifikaci protilátek.

16 kolonek dodávaných v každém balení lze použít se standardní mikrocentrifugou a jeden purifikační cyklus trvá méně než 20 min.

Každé balení Protein G HP SpinTrap™ obsahuje protokol pro obohacení proteinů cílových komplexů protilátka-antigen imunoprecipitací a protokol pro purifikaci protilátek.

Ab SpinTrap™ je další velikost balení kolonek Protein G HP SpinTrap™ (obrázek 3.8); s Ab SpinTrap™ je dodáváno 50 kolonek.

Obrázek 3.7. Kolony Protein G HP SpinTrap™ se používají k obohacování cílových proteinů pomocí protilátek navázaných na ligand proteinu G a používají se také k purifikaci protilátek v malém měřítku.

Obrázek 3.8. Kolonky Ab SpinTrap™ a sada Ab Buffer Kit umožňují rychlou purifikaci protilátek v malém měřítku pomocí mikrocentrifugy.

Purifikace protilátek ze séra bez čiření vzorku, ředění nebo filtrace je možná pomocí kolonek Protein G HP SpinTrap™ a Ab SpinTrap™. Při použití těchto kolonek se minimalizují ztráty cílového proteinu způsobené manuálními operacemi, jako je odstřeďování vzorku, přenášení vzorku do centrifugačních zkumavek a sběr supernatantu. Obrázek 3.9 ukazuje výsledek purifikace anti-HSA (lidský sérový albumin, pruh 2 na SDS gelu) pomocí kolony Ab SpinTrap™ z neředěného séra imunizovaného králíka.

Obrázek 3.9. SDS-PAGE (redukční podmínky; ExcelGel™ SDS Gradient 8-18; barvení Coomassie™ Blue) eluovaného poolu purifikovaného anti-HSA v neředěném séru imunizovaného králíka.

Obecná manipulace s kolonami SpinTrap™

Víčka a spodní uzávěry: Víčka a spodní uzávěry se používají během inkubace a eluce, ale ne během ekvilibrace a promývání. Před odstřeďováním sejměte spodní víčko a mírně otevřete víčko šroubovacího uzávěru (otočte víčkem o ~ 90° proti směru hodinových ručiček).

Sejmutí spodního víčka: Před dávkováním kapaliny do kolony SpinTrap™ odklopte spodní víčko. Nezapomeňte spodní víčko uschovat.

Inkubace: Před inkubací se ujistěte, že je médium plně suspendováno pomocí míchání na konci kolony. Všechny inkubace by měly být normálně prováděny při pokojové teplotě. Inkubace však mohou být prováděny při nižších teplotách, pokud je vhodnější pomalejší proces.

Po odstředění: Ihned po odstředění znovu vložte spodní uzávěr do spodní části kolony SpinTrap™ (před inkubačními a elučními kroky).

Sběr kapaliny:

Eluce: Po každém kroku umístěte kolonku SpinTrap™ do čerstvé 2ml mikrocentrifugační zkumavky (není součástí dodávky) pro sběr kapaliny.

Eluce:

Příprava vzorku

Obecné informace naleznete v kapitole Odsolování a výměna pufru 

Vzorek by měl mít před nanesením na kolonu pH kolem 7. V případě potřeby upravte podmínky vzorku na pH a iontovou sílu vazebného pufru buď výměnou pufru na odsolovací koloně (viz Odsolování a výměna pufru), nebo zředěním a úpravou pH.

Příprava pufru

Vazný pufr: 0,02 M fosforečnan sodný, pH 7,0

Eluční pufr: 0,1 M glycin-HCl, pH 2,7

Neutralizační pufr:

Voda a chemikálie použité pro přípravu pufru by měly být vysoce čisté. Před použitím pufry přefiltrujte přes filtr o průměru 0,45 µm.

Pufry lze připravit z 10× zásobních roztoků vazebných a elučních pufrů dodávaných se sadou Ab Buffer Kit (GE28903059).

Purifikace

1. Připravte si dvě sběrné zkumavky na každý vzorek pro eluované frakce, z nichž každá obsahuje 30 µl neutralizačního pufru.

Pro zachování aktivity acidolabilního IgG doporučujeme přidat 30 µl 1 M Tris-HCl pH 9. V případě, že se jedná o acidolabilní IgG, přidejte 30 µl acidolabilního IgG.0 do sběrných zkumavek, což zajistí, že finální pH vzorku bude přibližně neutrální.

2. Převraťte a opakovaně protřepejte kolonu, aby došlo k resuspenzi média. Odstraňte spodní uzávěr z kolony. Spodní uzávěr si uschovejte. Odstřeďujte 30 s při 70 až 100 × g, abyste odstranili zásobní roztok.
3. Ekvilibraci proveďte přidáním 600 µl vazebného pufru, odstřeďujte 30 s při 70 až 100 × g.
4. Vazbu protilátky proveďte přidáním max. 600 µl vazebného pufru. 600 µl vzorku protilátky. Pevně zajistěte horní uzávěr a inkubujte 4 min za jemného míchání. Odstřeďujte po dobu 30 s při 70 až 100 × g.

Následně lze provést několik aplikací vzorků, pokud není překročena kapacita kolony.

5. Promyjte přidáním 600 µl vazebného pufru, odstřeďujte 30 s při 70 až 100 × g.
6. Přidejte 400 µl elučního pufru a promíchejte inverzí. Umístěte kolonu do 2 ml mikrocentrifugační zkumavky obsahující 30 µl neutralizačního pufru (krok 1). Eluujte centrifugací po dobu 30 s při 70 × g a sbírejte eluát.
7. Umístěte kolonu do nové 2ml mikrocentrifugační zkumavky obsahující 30 µl neutralizačního pufru (krok 1). Odstřeďujte 30 s při 70 × g a seberte druhý eluát. Většina navázané protilátky se eluuje po dvou elučních krocích.

Odsoliďte a/nebo přeneste purifikované frakce IgG do vhodného pufru pomocí odsolovací kolony (viz odsolování a výměna pufru).