Fehlerbehebung in der molekularen Klonierung

Überblick über die molekulare Klonierung

Die molekulare Klonierung wird für das Zusammenfügen rekombinanter DNA-Moleküle und zum Steuern ihrer Replikation in Wirtsorganismen eingesetzt, wodurch mehrere DNA-Moleküle erzeugt werden. Klonierung beinhaltet die Replikation eines Moleküls, um eine Zellpopulation mit identischen DNA-Molekülen zu erzeugen. Sie wird häufig eingesetzt, um DNA-Fragmente, die ganze Gene enthalten oder eine DNA-Sequenz (wie Promoter, nicht-codierende Sequenzen und zufallsfragmentierte DNA) zu amplifizieren. Molekulare Klonierung ist der Prozess des Integrierens des Gens von Interesse (GOI) in einen Plasmidvektor. Dieser Vektor wird anschließend in eine Zelle eingebracht, die das vom GOI codierte Protein exprimiert. Sobald das Protein in der Zelle exprimiert ist, kann die Proteinexpression für verschiedene Studien genutzt werden (z. B. zelluläre Signaltransduktion, Morphologie oder andere Aspekte).

Die Klonierung ist nicht nur das Erzeugen von Kopien eines Gens oder anderer Zellbestandteile, sondern auch das Verändern eines Gens in einer DNA-Sequenz und die Replikation davon. Um eine DNA-Sequenz in einem lebenden Organismus zu amplifizieren, muss die Sequenz an einen Replikationsursprung gebunden werden und die eigene Vermehrung sowie die Vermehrung jeder verbundenen Sequenz steuern können (zum Beispiel: kann das Rapid DNA Dephos & Ligation Kit für die Klonierung verwendet werden).

Bedeutung/Anwendung der molekularen Klonierung

Die molekulare Klonierung wird für Folgendes verwendet:

• Zum Erforschen von Proteinen und ihrer Funktion. Durch die Verwendung rekombinanter DNA können Forschende die Replikation (Produktion rekombinanter Proteine) steuern und Zellen durch Klonierung manipulieren, wodurch sie mehr über die spezifischen Proteine in Erfahrung bringen und dieses Wissen auf Forschungsprojekte mit größerem Maßstab wie Erkrankungen und Pathogene anwenden können.¹
• Sie unterstützt beim Erforschen der genomischen Sequenz vieler verschiedener Spezies (einschließlich Menschen und Tiere) und beim Erzeugen von transgenen Organismen wie herbizidresistenten Pflanzen usw.
• Sie wird im Zellzyklus, der Genomorganisation, der Genexpression und der Gentherapie eingesetzt. Sie ist außerdem nützlich für die Entdeckung neuer Arzneimittel und die Synthese neuer rekombinanter Vakzine.
• Sie dient aufgrund ihrer Einfachheit, Wirtschaftlichkeit, Geschwindigkeit und Verlässlichkeit als wichtiges Instrument der klinischen Mikrobiologie. Die industrielle Anwendung dieser Technologie führt zur Produktion neuer Antibiotika in Form antimikrobieller Peptide und rekombinanter Zytokine, die als Therapeutika eingesetzt werden können.¹
• Mit dieser Technologie werden Gensonden entwickelt, die bei der frühen Diagnose von Erbkrankheiten, in der Forensik und in der routinemäßigen Diagnostik eine wichtige Rolle spielen.¹

Prozess der Klonierung

Die Klonierung eines DNA-Fragments umfasst im Wesentlichen die folgenden Schritte:

• Wahl des Klonierungsvektors (zum Beispiel: PSF-OXB20-FLUC – BAKTERIELLES LUCIFERASEPLASMID oder PSF-OXB20-BETAGAL – BAKTERIELLES BETA-GALACTOSIDASEPLASMID oder PSF-OXB20 – STARKES BAKTERIELLES PROMOTERPLASMID sowie Wirtsorganismen. Unterstützung bei der Wahl eines Vektors erhalten Sie in unserem Auswahlleitfaden für Expressionsvektoren
  
• Vorbereitung der Vektor-DNA (zum Beispiel: GenElute™ Plasmid-Midiprep-Kit, Plasmid-DNA aus E. coli RRI)
• Vorbereitung des zu klonierenden DNA-Fragments
• Erzeugung rekombinanter DNA mit DNA-Ligase (zum Beispiel: T4-DNA-Ligase)
• Einbringen oder Integrieren der rekombinanten DNA in den Wirtsorganismus:
• Das Integrieren der DNA in den Wirtsorganismus hängt von der gewählten Versuchsmethode ab (z. B. Transformation, Transduktion, Transfektion, Elektroporation)
• Auswahl von Organismen, die Vektorsequenzen enthalten
• Screening für Klone mit den gewünschten DNA-Inserts und biologischen Eigenschaften

Der detaillierte Artikel zur Klonierung ist im Molecular Biology handbook (Handbuch der Molekularbiologie) enthalten.

Beim Prozess der Klonierung werden verschiedene Probleme behandelt, die geprüft werden können. Nachstehend sind einige mögliche Ursachen und die empfohlenen Lösungen aufgelistet:

Wahl des Vektors

Legen Sie bei der Klonierung ein Augenmerk auf diese vier DNA-Segmente; das Fehlen eines dieser DNA-Segmente kann zu Problemen führen:

• Ein Ursprung der DNA-Replikation ist essenziell (für die Replikation im Wirt)
• Eine oder mehrere eindeutige Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen (an denen fremde DNA integriert werden kann)
• Ein selektierbares genetisches Markergen, das zum Ermöglichen des Überlebens von Zellen, die die Vektorsequenz aufgenommen haben, verwendet wird
• Ein zusätzliches Gen (das zum Screening von Zellen, die fremde DNA enthalten, eingesetzt wird)

DNA-Fragmentaufbereitung

Unvollständiger Restriktionsenzymverdau (RE-Verdau)

• Restriktionsenzym(e), das/die nicht vollständig spaltet/n: Das Überprüfen der Methylierungssensitivität des/der Enzyms/Enzyme ist erforderlich. Verwenden Sie den empfohlenen bereitgestellten Puffer mit dem Restriktionsenzym. Reinigen Sie die DNA auf, um Verunreinigungen, die das Enzym hemmen könnten, zu entfernen. (Sie können für bessere Ergebnisse die folgenden Produkte verwenden)
  
• Salzhemmung: Einige Enzyme sind salzempfindlich, weshalb die DNA vor dem Verdau aufgereinigt werden muss.
• PCR-Komponentenhemmung: Es ist erforderlich, das PCR-Fragment vor dem Restriktionsverdau aufzureinigen.
• Verwendung des falschen Puffers: Es soll ausschließlich der empfohlene Puffer, der mit dem Restriktionsenzym bereitgestellt wird, verwendet werden. (Doppelverdau: Der Aufschluss eines DNA-Substrats mit zwei Restriktionsenzymen gleichzeitig wird Doppelverdau genannt und ist ein gängiges Verfahren, um Zeit zu sparen). Für den Doppelverdau muss der richtige Puffer gewählt werden, mit dem die größte Aktivität für beide Enzyme erzielt wird. Es ist wichtig, das empfohlene Protokoll zu befolgen. Falls zwei unterschiedliche Inkubationstemperaturen notwendig sind, sollte der optimale Reaktionspuffer gewählt werden und die Reaktion entsprechend aufgebaut werden.
• Falls zu wenige Einheiten des Enzyms verwendet werden: Es wird allgemein die Verwendung von mindestens 3–5 Einheiten Enzym je µg DNA empfohlen.
• Kurze Inkubationszeit: Die Inkubationszeit muss verlängert werden.

Die verdaute DNA lief als Schmierspur auf einem Agarosegel.

• Das/die Restriktionsenzym(e) könnte(n) an das DNA-Substrat gebunden sein: SDS 0,1–0,5 % (zum Beispiel: Natriumdodecylsulfatlösung) muss zum Probenpuffer gegeben werden, um das Enzym von der DNA zu trennen.
• Nuklease-Kontamination: Der Einsatz eines frischen, sauberen Laufpuffers und eines frischen Agarosegels (zum Beispiel: Agarose mit geringer Geliertemperatur) sowie das Aufreinigen der DNA können unterstützend wirken.

Zusätzliche Banden oder Schmierspuren auf dem Gel

Falls größere Banden als erwartet auf dem Gel erscheinen, kann dies auf eine Bindung des/der Enzyms/Enzyme an das Substrat hinweisen: Die Anzahl der Einheiten in der Reaktion muss gegebenenfalls verringert werden und die Zugabe von SDS 0,1–0,5 % (zum Beispiel: Natriumdodecylsulfatlösung) zum Probenpuffer, um das Enzym vom Substrat zu trennen, kann dabei unterstützen.

Die Hybridisierungstemperatur könnte zu niedrig sein: Es muss die korrekte Hybridisierungstemperatur der Primer bestimmt werden. (Zum Beispiel: können KiCqStart^® SYBR^® Green Primer Hexanukleotid-Primer verwendet werden).

Keine Amplifikation des PCR-Fragments

Dies kann aufgrund folgender Ursachen, die während des Experiments geprüft werden müssen, auftreten:²

• Verwendung der falschen Primersequenz oder Fehler in den PCR-Primern
• Falsche Hybridisierungs- und Polymerisationstemperatur
• Falsche Primerkonzentration und zu wenige Polymeraseeinheiten: Es müssen die vom Hersteller empfohlene(n) Primerkonzentration und Polymeraseeinheiten auf der Grundlage des Reaktionsvolumens verwendet werden.
• Mg²⁺-Konzentrationen, Puffer-pH-Wert und Zyklusbedingungen in der Reaktion:  Notwendigkeit einer starken Optimierung für die Amplifikationsreaktion.

Erzeugen rekombinanter DNA unter Verwendung von DNA-Ligase

• Verwendung der maximalen Ligationsmischung: Es muss die empfohlene Menge der Ligationsreaktion für die Transformation verwendet werden. (Zum Beispiel: können das QuickLink™ DNA Ligation Kit und Rapid DNA Ligation Kit für eine hocheffiziente und schnelle Ligation verwendet werden.
• Ineffiziente Ligation: Bestätigen Sie, dass mindestens ein zu ligierendes Fragment eine 5‘-Phosphateinheit enthält. Reinigen Sie die DNA auf, um Verunreinigungen wie Salz und EDTA zu entfernen. Entfernen Sie Phosphatase vor der Ligation. Eine Bestätigung der Ligaseaktivität durch eine Ligationskontrolle kann helfen.
• Ineffiziente Phosphorylierung:  Die DNA muss vor der Phosphorylierung aufgereinigt werden, um überschüssiges Salz, Phosphat oder Ammoniumionen, welche die Kinase hemmen könnten, zu entfernen.
• Ineffiziente Abstumpfung: Eine Hitzeinaktivierung oder Entfernung der Restriktionsenzyme und eine Aufreinigung der PCR-Fragmente vor der Abstumpfung können helfen.
• Ineffiziente A-Schwanzbildung: Die PCR muss vor der A-Schwanzbildung aufgereinigt werden. High-Fidelity-Enzyme entfernen die nicht Template-bestimmten Nukleotide

Die ligierte DNA lief als Schmierspur auf dem Agarosegel

• Die Ligase ist an das DNA-Substrat gebunden: Die Ligationsreaktion muss vor dem Laufen auf einem Gel mit Proteinase K (zum Beispiel: Proteinase K aus Tritrachium album) behandelt werden.

Integrieren der rekombinanten DNA in den Wirtsorganismus

• Falls die Zellen nicht lebensfähig sind: Notwendigkeit zum Berechnen der Transformationseffizienz der kompetenten Zellen oder Verwendung von im Handel erhältlichen hocheffizienten kompetenten Zellen. Zum Beispiel: SIG10 Chemisch kompetente Zellen (CMC0001) weisen eine hohe Transformationseffizienz von > 1 × 10⁹ KBE/µg auf
• Das Gen von Interesse (GOI) kann toxisch für die Zellen sein: Die Platten müssen bei niedrigerer Temperatur inkubiert werden oder es muss ein Stamm verwendet werden, der eine größere Transkriptionskontrolle über das DNA-Fragment oder Gen von Interesse ausübt. Zum Beispiel: können CONTROLLER SIG10 Chemisch kompetente Zellen verwendet werden.
• Falls das falsche Hitzeschock-Protokoll (für chemisch kompetente Zellen) verwendet wird: Es muss das spezifische Transformationsprotokoll des Herstellers beachtet werden und es ist hilfreich, während des Hitzeschocks die empfohlene Temperatur zu verwenden.
• Falls in der Ligationsmischung PEG vorhanden ist (bei elektrokompetenten Zellen): Muss die DNA vor der Transformation durch Tropfendialyse aufgereinigt werden.
• Wenn im Fall von elektrokompetenten Zellen keine Spannung erfasst wird: Muss die DNA vor dem Ligationsschritt aufgereinigt und Luftblasen entfernt werden. Müssen die spezifischen Elektroporationsparameter des Herstellers beachtet werden.
• Die erzeugte DNA ist zu groß: Es muss ein kompetenter Zellstamm gewählt werden, der mit großen DNA-Konstrukten effizient umgewandelt werden kann. Die Verwendung von Elektroporation könnte ebenfalls unterstützen. Zum Beispiel: XLDNA SIG10 Elektrokompetente Zellen können für große Konstrukte und eine Steigerung der DNA-Ausbeuten eingesetzt werden.
• Bilden eines DNA-Fragments, das anfällig für eine Rekombination sein könnte:  Muss geprüft werden. Zum Beispiel: STEADY Chemisch kompetente Zellen können verwendet werden:
• Für die Auswahl von Organismen, die eine Vektorsequenz enthalten, eines selektierbaren Markers (in der Regel ist ein Gen essenziell), der eine Antibiotikaresistenz verleiht.
  Falsches Antibiotikum oder falsche Konzentration davon: Das Antibiotikum muss bestätigt und seine Konzentration optimiert werden. Der Selektionsmarker, der für den Vektor verwendet wird, muss ebenfalls bestätigt werden. Zum Beispiel kann Hygromycin B aus Streptomyces hygroscopicus als Marker verwendet werden. Nachstehend finden Sie eine Tabelle mit Beispielen für Antibiotika sowie deren Arbeitskonzentration.

Tabelle 1. Einige häufig eingesetzte Antibiotika, ihr Mechanismus und allgemeine Arbeitskonzentrationen.

Name des Antibiotikums	Klasse	Wirkungsmechanismus*	Art	Arbeitskonzentration**
Kanamycin (Produkt-Nr. K1377)	Aminoglycosid	Bindet die ribosomale 30S-Untereinheit; verursacht eine Fehltranslation	Bakterizid	100 mg/l
Spectinomycin (Produkt-Nr. S4014)	Aminoglycosid	Bindet die ribosomale 30S-Untereinheit; unterbricht die Proteinsynthese	Bakterizid	7,5–20 mg/l
Ampicillin (Produkt-Nr. A6140, A9393 und A9518)	Beta-Lactam	Hemmt die Zellwandsynthese	Bakterizid	20–60 µg/ml
Carbenicillin (Produkt-Nr. C3416)	Beta-Lactam	Hemmt die Zellwandsynthese	Bakterizid	100 µg/ml
Bleomycin (Produkt-Nr. B5507)	Glycopeptid	Induziert DNA-Brüche	Bakterizid	10–100 µg/ml
Erythromycin (Produkt-Nr. E6376)	Makrolid	Blockiert die ribosomale 50S-Untereinheit; hemmt die Aminoacyl-Translokation	Bakteriostatikum	50–200 mg/l
Polymyxin B (Produkt-Nr. P1004)	Polypeptid	Verändert die Permeabilität der äußeren Membran	Bakterizid	10–100 µg/ml
Tetracyclin (Produkt-Nr. T3383)	Tetracyclin	Bindet die ribsomale 30S-Untereinheit; hemmt die Proteinsynthese (Elongationsschritt)	Bakteriostatikum	10 mg/ml
Chloramphenicol (Produkt-Nr. C0378)		Bindet die ribosomale 50S-Untereinheit; hemmt die Peptidyl-Translokation	Bakteriostatikum	10–20 µg/ml
*In Prokaryoten. **In Reinstwasser lösen und sterilfiltrieren, sofern nicht anders angegeben.

Zusätzlich zu den in der Anleitung zur Fehlerbehebung gezeigten Ursachen können die folgenden Probleme auch mit einer geringen oder keiner Transformationseffizienz zusammenhängen und überprüft werden.

• Verunreinigungen in der DNA: Phenol, Proteine, Detergenzien und Ethanol müssen beim Einsatz von chemisch kompetenten Zellen (d. h. BL21 (DE3)) aus der DNA-Lösung entfernt werden. Ethanol fällt in Ligationen aus, um Plasmid-DNA aufzureinigen, wenn elektrokompetente Zellen, d. h. BL21 (DE3)  eingesetzt werden (da Salz und Puffer die Elektroporation stark hemmen und das Risiko für eine Lichtbogenbildung steigern). DNA kann auch in sterilem Wasser gelöst werden, um auf weitere Verunreinigungen zu prüfen.
• Überschüssige/s DNA oder Volumen: Dies muss geprüft werden und es muss nur das abhängig von der Art der verwendeten Zellen empfohlene Volumen hergestellt werden.
• Geringe oder schlechte Expression der Antibiotikaresistenz: S.O.C.-Medium wird statt LB-Medium für die Expression empfohlen, da es die Transformationseffizienz um das zwei- bis dreifache verringert.
• Ungeeignete Lagerung und Handhabung kompetenter Zellen: Lagern Sie kompetente Zellen bei -80 °C und nicht in flüssigem Stickstoff. Kompetente Zellen sollen nach dem Auftauen umgehend verwendet werden und bis zum Gebrauch auf Eis gekühlt bleiben. Minimieren Sie die Anzahl der Gefrier-Auftau-Zyklen.
• Langsames oder kein Wachstum der Zellen oder übermäßiges Wachstum: Das Verwenden der empfohlenen Temperatur kann das richtige Wachstum der Zellen unterstützen. Bei einem übermäßigen Wachstum muss insbesondere auf das verwendete Antibiotikum und dessen Konzentration geachtet werden.
• Ungenaue Berechnungen: Stellen Sie sicher, dass die richtigen Verdünnungsfaktoren und DNA-Mengen zum Berechnen der Effizienz herangezogen werden.

Klon-Screening

Kolonien ohne Plasmid:

• Unzureichende Antibiotikamenge verwendet:  Die Antibiotikamenge auf den Platten muss auf die empfohlene Menge erhöht werden. Die Verwendung von frischen Platten mit frischen Antibiotika kann unterstützend wirken. Weitere Informationen sind in Tabelle 1 enthalten.
• Auswahl von Satellitenkolonien: Für die weitere Analyse müssen große, fest etablierte Kolonien gewählt werden.
  (Satellitenkolonien sind sehr kleine Zellkolonien, die um eine antibiotikaresistente Kolonie wachsen und das falsche Plasmid aufgenommen haben. Die antibiotikaresistenten Kolonien setzen Enzyme frei, die das Antibiotikum zersetzen. Die Satellitenkolonien wachsen nicht, wenn sie auf ein frisches Medium übertragen werden. Sie werden für die weitere Analyse also nicht in Betracht gezogen.)

Kolonien, die das falsche Konstrukt enthalten, können auftreten aufgrund von:

• Rekombination des Plasmids (Vektor)
• Während der Klonierung wurde das falsche PCR-Amplikon verwendet: Die PCR-Bedingungen müssen optimiert werden. 
• Vorhandensein einer internen Erkennungsstelle: Die Einsatzsequenz für das Vorhandensein einer internen Erkennungsstelle muss analysiert werden.
• Vorhandensein von Mutanten/Fehlern in der Sequenz:
  • Verwendung von DNA-Polymerase mit geringer Genauigkeit: Verwenden Sie eine DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit und Korrekturleseaktivität, zum Beispiel: Ein weiteres erneutes Durchführen der Sequenzierungsreaktion kann hilfreich sein.
  • Die DNA wurde während der Exzision aus dem Gel durch UV-Licht beschädigt: Es wird die Verwendung eines Leuchtkastens mit langen UV-Wellen (360 nm) während der Exzision der DNA aus dem Agarosegel empfohlen.

Überlegung für die PCR-Klonierung

• Die Art des verwendeten Inserts oder Fragments: Die Effizienz des PCR-Fragments unterscheidet sich aufgrund der Fragmentgröße, Insert-Toxizität und Komplexität des Inserts.
• Insert-Größe: Kleine DNA-Fragmente werden für eine hohe Effizienz in Erwägung gezogen.
• Verhältnis von Vektor zu Insert:  Es ist essenziell und wichtig, die molaren Konzentrationsverhältnisse des Vektors zum Insert für eine effiziente Klonierung zu optimieren.
• Verwendung eines reinen PCR-Produkts: Es wird empfohlen, ein reines PCR-Produkt zu verwenden. In einigen Fällen kann ein frisches Produkt hilfreich sein. (Zum Beispiel kann rAPid Alkalische Phosphatase für die Aufreinigung des PCR-Produkts durch das Entfernen von dNTP verwendet werden).
• Verwendung von Positiv- und Negativkontrollen: Es ist essenziell, eine geeignete Positiv- und Negativkontrolle für die Bewertung der Ergebnisse eines Klonierungsereignisses zu haben.
• Kompatibilität von DNA-Enden des Vektors und Inserts: Dies muss geprüft werden. Für eine erfolgreiche Klonierung ist die Verwendung der korrekten Polymerase mit dem Klonierungsvektor wichtig. Die Verwendung eines SnapFast™ Vektors macht die Klonierung effizient und einfach, da er das Übertragen der DNA von einem Vektor auf einen anderen erleichtert. Er ist mit vielen bereits vorhandenen Klonierungsvektoren und einer Reihe von Shuttle-Vektoren kompatibel, um den Gentransfer mit hohen Erfolgsquoten zu ermöglichen.
• Das richtige Design für Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer sowie der Sonden ist von hoher Bedeutung.³

Literatur

1. Sharma K, Mishra AK, Mehraj V, Duraisamy GS. 2014. Advances and applications of molecular cloning in clinical microbiology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 30(1):65-78. https://doi.org/10.1080/02648725.2014.921501

2. Roux KH. 2009. Optimization and Troubleshooting in PCR. Cold Spring Harbor Protocols. 2009(4):pdb.ip66-pdb.ip66. https://doi.org/10.1101/pdb.ip66

3. Raso A, Mascelli S, Nozza P, Ugolotti E, Vanni I, Capra V, Biassoni R. 2011. Troubleshooting fine-tuning procedures for qPCR system design. J. Clin. Lab. Anal.. 25(6):389-394. https://doi.org/10.1002/jcla.20489

4. Canene-Adams K. 2013. Explanatory Chapter.271-278. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-418687-3.00022-7

5. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. JoVE.(63): https://doi.org/10.3791/3998

6. Fulton TL, Stiller M. 2012. PCR Amplification, Cloning, and Sequencing of Ancient DNA.111-119. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-516-9_15

7. Mergulhão F, Kelly A, Monteiro G, Taipa MA, Cabral JM. Troubleshooting in Gene Splicing by Overlap Extension: A Step-Wise Method. MB. 12(3):285-288. https://doi.org/10.1385/mb:12:3:285

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