Klonierung von Zielgenen in einen Plasmidvektor

Oxford Genetics

• Auswahl des Klonierungssystems und des Plasmidvektors
• Plasmid-Restriktionsverdau
• Fragment-Restriktionsverdau
• Gel-Exzision
• Bereinigen von Gel-Fragmenten
• Hybridisieren von DNA-Oligos für die Ligation
• Anfügen von 5'-Phosphaten an die DNA
• Dephosphorylierung von DNA
• Vorbereitung der DNA für die Blunt-End-Klonierung
• Ligatur der DNA zur Gewinnung eines Plasmids, welches das betreffende Gen enthält
• Ortsspezifische Mutagenese

 

Auswahl des Klonierungssystems und des Plasmidvektors

Gentechnik wird in Tausenden Laboren weltweit eingesetzt. Angesichts ihrer Bedeutung ist es bemerkenswert, dass die Klonierungsstrategien für viele der gängigen DNA-Bestandteile nicht standardisiert sind. Zu diesem Mangel an Standardisierung tragen die vielen Optionen bei, die für Klonierungskits und innovative Technologien zur Verfügung stehen.  Es ist nicht immer notwendig, ein IP-heavy-Kit zu verwenden, da die traditionelle Klonierung durch Restriktionsenzymverdau mit standardisierten Plasmiden von Oxford Genetics noch einfacher ist.

Das Ziel von Oxford Genetics war es, ein DNA-Plasmidsystem zu entwickeln, das den Großteil funktionaler DNA-Inserts, die ein Forscher benötigt, in einem einzigen Plasmid unterbringen kann. Durch die Optimierung unseres Ausgangsvektors kann jede DNA-Komponente unseres Systems entfernt und durch Hunderte anderer DNA-Abschnitte ersetzt werden, die von uns vorab definiert und getestet wurden. Dieses Konzept wird SnapFast™ Konzept genannt. Unsere gesamten Konstrukte wurden vorab auf unzureichende Codon-Nutzung und nicht miteinander verträgliche Restriktionsstellen geprüft. Wo es möglich war, wurden seltene Codons und Restriktionsstellen entfernt, um eine effiziente Expression zu ermöglichen und sicherzustellen, dass Restriktionsstellen die Klonierung anderer SnapFast DNA-Abschnitte nicht einschränken.

Wir verfügen über eine der größten Plasmidsammlungen weltweit und bieten für fast jedes Insert, das wir anbieten, mehrere Expressions- und Klonierungsoptionen. Unsere Produktpalette umfasst:

• Die größte weltweit verfügbare Auswahl an Peptid-Tags (26)
• Insgesamt 9 Reportergene in 5 Konfigurationen
• Mehr als 20 Signalpeptide
• Über 40 Promoter für die Expression in Säugern, Bakterien und Hefen
• Insgesamt 10 Optionen zur Auswahl von Antibiotika und Stoffwechselprodukten

Vorteile des SnapFast-Systems:

• Alle Plasmide sind kompatibel mit Standardklonierung, LIC, InFusionHD, Gibson Assembly, Seamless Geneart.
• Es sind mehr als 1600 unverwechselbare und kompatible DNA-Abschnitte verfügbar.
• Leichte, effiziente und einfache technische Strategien.
• Hohe Erfolgsquoten aufgrund der Kompatibilität durch vorab erfolgte Definition.
• Keine Größenbeschränkungen für Inserts. Niedriger Kopierursprung für mehr Stabilität.
• Zur Vereinfachung des Gentransfers mit vielen bereits vorhandenen Klonierungsvektoren und einer Reihe von Shuttle-Vektoren kompatibel.
• Einfaches Klonieren aus den SnapFast-Vektoren in eine Reihe alternativer Systeme, einschließlich viraler Vektoren.
• Eingebaute regulatorische Sequenzen und Leistungsspektren (z. B. Gen-Concatamerisierung, Isolatoren und Terminatorsequenzen).

Leistungsmerkmal	SnapFast	Gateway	TOPO	Gibson	LIC	InFusionHD	Electra
Planung von Klonierungsstrategien	Leicht	Mittel	Leicht	Schwer*	Schwer*	Schwer*	Schwer*
Nahtlose Fusion mit Tags	Ja	Nein	Nein	Ja	Ja	Ja	Ja
Patentierte Klonierungsmethoden	Nein	Ja	Ja	Ja	Nein	Ja	Ja
Lizenz für kommerzielle Forschung erforderlich	Nein	Ja**	Ja**	Nein	Nein	Nein	Nein
Plasmidanzahl	> 1650	< 100	< 20	N/A	N/A	N/A	< 200
Kosten	$	$$$	$$$	$	$	$$	$
Eindeutige Klonierungspositionen in jedem Plasmid	> 20	1	1	N/A	N/A	N/A	1
Eingangsvektoren erforderlich	Nein	Ja	Ja	Nein	Nein	Nein	Ja
Einbindung in ein Klonierungssystem?	Nein	Ja	Ja	Nein	Nein	Nein	Ja
Sequenzierungsprimer	20 – vollständige Abdeckung	2	2	N/A	N/A	N/A	Keine
Online bereitgestellte Sequenzen	Ja	Ja	Ja	N/A	N/A	N/A	Nein

* Erfordert Primerdesign unter Einsatz von Homologie- oder Typ IIS-Stellen
** Einschränkung der Verwendung der Klonierungstechnologie oder -produkte durch Patente
^ Online-Tools verfügbar zur Unterstützung der Planung
LIC = Ligase-unabhängige Klonierung (Ligase Independent Cloning)

Plasmid-Restriktionsverdau

Bei einem präparativen Verdau wird die DNA geschnitten, um sie für die Ligation mit einem anderen Teil der DNA vorzubereiten, nicht nur, um die Identität der DNA zu bestätigen. Es ist wichtig zu versuchen, den Verdau des Fragments und des Vektors zur gleichen Zeit einzurichten. Dadurch kann Zeit gespart werden. Dieses Protokoll geht von einer Plasmidlösung in Tris-EDTA (TE) oder Elutionspuffer (EB) oder nukleasefreiem H₂O aus, die 200-300 ng/µl und etwa 3-5 kb enthält. Bei größeren Plasmiden muss möglicherweise ein größeres Volumen verwendet werden, da bei gleicher Konzentration weniger Plasmidkopien vorhanden sind.

In diesem speziellen Beispiel wäre folgendes Verfahren denkbar:

10-20 µl Plasmid (200-300 ng/μl, Gesamtmenge 3-5 µg)
10 µl 10X Restriktionspuffer
10 µl 10X Rinderserumalbumin (BSA, Endkonzentration üblicherweise 100 µg/ml) (Bestell-Nr. A7906)
1,5-2 µl Restriktionsenzym 1 (10-20 Einheiten/µl)
1,5-2 µl Restriktionsenzym 2 (optional)
Auffüllen auf 70 oder 100 µl Gesamtvolumen mit TE (Bestell-Nr.  T9285) oder nukleasefreiem Wasser (Bestell-Nr. W4502)

Die vorgenannten Reagenzien in ein steriles 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen geben, zunächst TE oder Wasser, dann das Plasmid/die DNA, dann den Restriktionspuffer und BSA hinzugeben und gründlich mischen. Schließlich das/die Restriktionsenzym(e) hinzufügen. Die Auswahl der Restriktionsenzyme hängt von den Zielen und der Plasmidkarte ab, kann aber EcoR I, BamH I oder Hind III umfassen. Die Reaktion bei der richtigen Temperatur inkubieren (in der Regel 37 °C, dabei immer sicherstellen, dass es sich nicht um eine Ausnahme handelt, wie z. B. SwaI bei 25 °C) und den Zeitmesser einschalten (Hochzählen lassen). Die Reaktion 40-60 Minuten durchlaufen lassen. Nun kann der Vektor mit alkalischer Phosphatase (CIP) dephosphoryliert werden. Ggf. können die Restriktionsenzyme zu diesem Zeitpunkt deaktiviert werden, dies ist gängige Praxis.

Den Verdau auf einem Agarosegel durchführen (mit einem sehr großen Well, um eine große Probe zu laden) und die Ergebnisse auf eine einzelne Bande in der Größe des linearisierten Plasmids untersuchen. Es gibt drei mögliche Ergebnisse aus diesem Verdau:

• Hat überhaupt nicht funktioniert. Ein längerer Verdau ist sinnlos, weil die Reaktion fehlgeschlagen ist. Wenn das Enzym bereits vorher bei einem anderen Plasmid funktioniert hat, sollte das zu schneidende Plasmid ggf. erneut ausgefällt oder eine neue Phenol-Extraktion vor der Ausfällung durchgeführt und ein neuer Versuch gestartet werden. Andernfalls überprüfen, ob das Enzym noch in Ordnung ist, indem ein anderes Plasmid eingesetzt wird.
• Hat funktioniert, aber der Vektor ist nach 40 Minuten noch nicht vollständig geschnitten (erkennbar an mehr als einer Bande mit dem ungefähren Molekulargewicht, das vom Vektor erwartet wird). Anhand des Fortschritts kann abgeschätzt werden, wie lange es noch dauern wird, und ein weiterer Verdauversuch unternommen werden.
• War ein vollständiger Verdau Sie haben ein lineares Plasmid, das für ein Ligationsverfahren geeignet ist.

Tipp: Restriktionsenzyme sind sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen und sollen deshalb nicht auf Eis gelegt werden. Am besten eine Kühlbox mit einer Temperatur von -20 °C verwenden. Vermeiden Sie es auch, sie mit den Fingern am Boden des Röhrchens festzuhalten, und versuchen Sie, beim Umgang mit den Enzymvorräten schnell zu arbeiten. Sie werden lange halten, wenn man sie pflegt.

Fragment-Restriktionsverdau

Dies ist ein Protokoll für einen präparativen Verdau, d. h. das Schneiden von DNA, um diese für die Ligation mit einem anderen DNA-Stück vorzubereiten, nicht nur, um die Identität der DNA zu bestätigen. In der Regel handelt es sich bei diesen DNA-Stücken um zirkuläre Plasmide, es können aber auch PCR-Fragmente sein. Es ist wichtig zu versuchen, den Verdau des Fragments und des Vektors zur gleichen Zeit einzurichten. So kann später Zeit gespart werden.

Dieses Protokoll geht von einer Plasmidlösung in Tris-EDTA (TE) oder Elutionspuffer (EB) oder nukleasefreiem H₂O aus, die 200-300 ng/µl und etwa 3-5 kb enthält. Bei größeren Plasmiden muss möglicherweise ein größeres Volumen verwendet werden, da bei gleicher Konzentration weniger Plasmidkopien vorhanden sind.

In diesem speziellen Beispiel wäre folgendes Verfahren denkbar:

10-20 µl Plasmid (200-300 ng/μl, Gesamtmenge 3-5 µg)
7,5 µl 10X Restriktionspuffer
7,5 µl 10X Rinderserumalbumin (BSA, Endkonzentration üblicherweise 100 µg/ml) (Bestell-Nr. A7906)
1,5-2 µl Restriktionsenzym 1 (10-20 u/µl)
1,5-2 µl Restriktionsenzym 2 (optional)
Mit TE (Bestell-Nr. T9285) oder nukleasefreiem Wasser (Bestell-Nr. W4502) auf insgesamt 70 µl auffüllen

DNA-Fragment-Restriktionsverdauprotokoll

Die vorgenannten Reagenzien in ein steriles 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen geben, zunächst TE oder Wasser, dann das Plasmid/die DNA, dann den Restriktionspuffer und BSA hinzugeben und gründlich mischen. Schließlich das/die Restriktionsenzym(e) hinzufügen. Die Reaktion bei der richtigen Temperatur inkubieren (in der Regel 37 °C, dabei immer sicherstellen, dass es sich nicht um eine Ausnahme handelt, wie z. B. SwaI bei 25 °C) und den Zeitmesser einschalten (Hochzählen lassen). Die Reaktion 40-60 Minuten durchlaufen lassen. Den Verdau auf einem Agarosegel durchführen (mit einem sehr großen Well, um eine große Probe zu laden) und die Ergebnisse für eine einzelne Bande in der Größe des Inserts untersuchen.

Gel-Exzision von DNA-Fragmenten

Zum Ausschneiden der Bande wird ein sauberes Skalpell oder eine Rasierklinge benötigt. Ein wichtiger Aspekt ist die Menge der Agarose, die mit der DNA genommen wird. Je höher das Verhältnis zwischen der DNA-Menge und der Agarose ist, desto weniger Verunreinigungen werden bei der Ligation mitgeführt.

Die Standardmethode zur Extraktion von DNA aus Agarosegelen ist die Visualisierung von Ethidiumbromid (Bestell-Nr. H5041) unter UV-Licht. Dies ist nicht ideal, da die UV-Strahlung die DNA schädigt, Mutationen verursachen und die Ligationsleistung verringern kann. Eine Alternative ist die Verwendung eines Dark Reader Trans-Illuminators von Clare Chemical, aber es kann manchmal schwierig sein, geringe Bandenmengen zu erkennen. Wenn eine große DNA-Menge zur Verfügung steht, sind diese Systeme ideal. Alternativ kann eine Blind-Exzision durchgeführt werden, indem eine kleine Menge der geschnittenen DNA in der Reihe neben dem großen Well laufen gelassen und deren Position genutzt wird, um eine große DNA-Menge in das nächste Well zu exzidieren. Seien Sie bei dieser Technik sehr vorsichtig, da einige Banden in Längsrichtung/von oben nach unten im Gel recht schmal sein und übersehen werden können, wenn nicht genau gearbeitet wird. Nach der Exzision kann das verbleibende Gel betrachtet werden, um zu sehen, ob die Bande erhalten wurde. Tun Sie das schnell, denn wenn Sie die DNA nicht erhalten haben, wollen Sie sie nicht mit dem UV-Licht beschädigen.

Seien Sie vorsichtig mit DNA-Fragmenten, die eng beieinander liegen. Der Schlüssel zu dieser Technik ist die Trennung des Vektorgerüsts vom Fragment, um Kontaminationen vorzubeugen. Nur weil Sie beim Ausschneiden etwas nicht sehen können, heißt das nicht, dass es nicht da ist. Sie sehen nur den Gipfel einer Gaußschen Verteilung der DNA, und obwohl die Banden getrennt aussehen können, sind sie es vielleicht trotzdem nicht. Sie könnten versehentlich etwas DNA von nahe beieinander liegenden Banden erhalten.

Tipp: Das ist ein relativ gefährliches Verfahren, was die Molekularbiologie anbelangt. UV-Licht, krebserregendes Ethidiumbromid und ein Skalpell sind eine gute Grundlage für ein Desaster. Bitte halten Sie sich an alle Sicherheitsvorschriften und -bestimmungen vor Ort und wenden Sie sich an den lokalen Sicherheitsbeauftragten, wenn Sie sich nicht sicher sind, welche Vorsichtsmaßnahmen zu treffen sind.

Tipp: Erwägen Sie die Wahl einer sichereren Chemikalie für die Visualisierung von DNA. Sowohl Nancy 520 (Bestell-Nr. 01494) als auch Syber Safe (Bestell-Nr. S9305 und S9430) sind nachweislich weniger mutagen als Ethidiumbromid.

Bereinigen von Gelfragmenten

Für die Gelextraktion eines DNA-Fragments aus einem Agarosegel lohnt sich in der Regel nur die Verwendung eines vorbereiteten Kits, wie z. B. das GenElute™ Gel-Extraktionskit, Bestell-Nr. NA1111. Sie sind relativ günstig und hocheffizient. Es gibt auch andere Methoden, die kein Kit erfordern (z. B. Dialyseschläuche und das Zusammendrücken des Gelfragments zwischen Parafilm, um die DNA in Lösung auszupressen), aber diese Methoden führen häufig zu einem hohen Anteil an Verunreinigungen und einer geringen DNA-Ausbeute.

DNA-Gel-Extraktionskits bestehen in der Regel entweder aus Beads oder Spin-Säulen. Die Größe der DNA-Fragmente, die jedes Kit verarbeiten kann, kann variieren. Vergewissern Sie sich daher, dass das Kit den Größenbereich der DNA, mit der gearbeitet wird, extrahieren kann. Die meisten Kits decken einen Bereich von 100 bp bis 5 kb ab, einige haben aber auch niedrigere oder höhere Kapazitäten.

Das Prinzip sowohl der Spin-Säule als auch der Bead-Kits besteht darin, die DNA an etwas zu binden (in der Regel ein Kieselharz) und dann die Verunreinigungen entweder durch Pelletieren der Beads oder durch Waschen der Säule auszuwaschen. Im abschließenden Elutionsschritt wird die DNA vom Harz/von den Beads/von der Säule gelöst und ein sauberes DNA-Fragment geliefert. Allerdings kann auch das beste Extraktionskit noch Verunreinigungen mit sich führen, weshalb die Verwendung großer Mengen einer durch Gelextraktion gewonnenen Lösung in einer Ligation vermieden werden sollte. Manchmal ist "weniger mehr", wenn es darum geht, Ihr Fragment zu Ihrer Ligation hinzuzufügen. Versuchen Sie zu vermeiden, dass eine Ligation aus mehr als 30 % des Volumens der durch Gelextraktion isolierten Flüssigkeit besteht.

Variabilität des Gel-Extraktionskits

Wir haben in unseren Laboren sechs verschiedene DNA-Gel-Extraktionskits direkt getestet, weil dieses Verfahren von großer Wichtigkeit für unsere Arbeit ist. Wir haben festgestellt, dass einige Kits konstant hohe Erträge und reine DNA liefern, während andere manchmal gute Erträge liefern, aber manchmal versagen, und wieder andere durchweg unterdurchschnittlich abschneiden.

Wenn ein Fragment aus einem Plasmid in einem Gel extrahiert wird, ist mit Wahrscheinlichkeit damit zu rechnen, dass die DNA-Konzentration (bei Verwendung eines Spektralphotometers) niedrig ist, da mit einem großen Plasmid (höchstwahrscheinlich etwa 5 kb) begonnen und dann eine viel kleinere Teilfraktion (vielleicht 1 kb) herausgeschnitten wurde, und die Kits niemals erneut 100 % der DNA aus dem Gel aufreinigen werden. Eine Ausbeute von 20 ng/ul in 35 ul Gesamtvolumen für ein 1 kb-Fragment, das aus 5 ug Plasmid-DNA (5 kb) isoliert wurde, wäre also nicht allzu schlecht (70 % der DNA wurden wiedergewonnen).

Wir stellen häufig fest, dass der Grad der Verunreinigungen oder die Qualität der DNA-Präparation ein wichtigerer Faktor für den Klonierungserfolg ist als die DNA-Ausbeute selbst. Wir haben auch immer wieder beobachtet, dass die Zugabe von mehr Fragmenten zu einer Ligation den Klonierungserfolg im Vergleich zur gleichen Reaktion mit etwas weniger Fragmenten verringert. Obwohl dies einfach daran liegen könnte, dass die zusätzlichen DNA-Enden die Ligase von den Vektorenden weg titrieren, kann die Zugabe von zu viel aus dem Gel extrahiertem Material dazu beitragen, weil die Verunreinigungen in der Präparation aus dem Gel gering sind.

Hybridisieren von DNA-Oligos für die Ligation

Das Grundkonzept der Hybridisierung von Oligos besteht darin, zwei Oligonukleotide so zu erhitzen, dass sie denaturieren, und dann abzukühlen, damit die beiden Oligos eine Basenpaarung eingehen können. Informationen über benutzerdefinierte Oligos sind unter OLIGO aufgeführt. Dieses Verfahren wird häufig verwendet, um kurze DNA-Abschnitte vorzubereiten für:

• Erstellen von shRNA-DNA-Regionen für die Ligation
• Erstellen von microRNA-DNA-Regionen für die Ligation
• Hinzufügen eines Linkers zum Entfernen oder Hinzufügen einer Restriktionsstelle.
• Studien, die kleine doppelsträngige DNA-Regionen erfordern, wie z. B. DNA-Protein-Bindungsassays.

Die Kosten für den Kauf einer Vielzahl phosphorylierter Oligos können enorm hoch sein. Aus diesem Grund ligieren viele Gruppen Oligos einfach in Vektoren, die nicht de-phosphoryliert wurden. Dies ist besonders effektiv, wenn die Oligos in einen Vektor ligiert werden sollen, der mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten wurde, die inkompatible Enden haben (und verhindern, dass sich der Vektor selbst schließt). Der Hintergrund der Ligationsreaktion kann immer noch hoch sein, aber die Oligos sind bei Oligoligationen oft in erheblichem Überschuss vorhanden, sodass die Reaktion trotzdem funktionieren sollte.

Es ist auch möglich, die Oligos zunächst mit Hilfe von Polynukleotidkinase (PNK) zu phosphorylieren, aber die Aufreinigung der Oligos ist schwierig, da sie aufgrund ihrer Kürze wahrscheinlich nicht an eine DNA-Aufreinigungssäule binden werden. PNK-Reaktionen werden jedoch in Ligasepuffer durchgeführt, sodass dies gegebenenfalls nicht erforderlich ist. Allerdings muss die PNK hitzeinaktiviert werden, bevor das Oligo in die Ligation eingebracht wird, da die PNK sonst den Vektor phosphoryliert.

Mit der Phosphoramidit-Chemie, mit der Oligos im Allgemeinen hergestellt werden, lassen sich normalerweise 40-50 Basen ohne allzu viele Fehler herstellen, doch führt die Verwendung dieser Technik zur Herstellung von Oligos mit 100 oder mehr Basen häufig zu Mutationen. Wir haben oft die Erfahrung gemacht, dass es besser ist, ein langes Oligo in zwei kürzere Oligos aufzuteilen, wobei die beiden Oligos in der Mitte um 10-15 Basenpaare überlappen sollten, damit sie sich miteinander verbinden können. Die Mutationshäufigkeit nach der Sequenzierung sollte viel geringer sein.

Die Abkühlungsphase beachten. Wir haben versucht, die Oligos in einem Wasserbad abzukühlen, indem wir es einfach auf 95 Grad erhitzt und dann zum Abkühlen abgeschaltet haben, oder indem wir sie in einem Becherglas auf einem Stativ auf 100 Grad erhitzt (alte Schule) und dann das Becherglas zum Abkühlen in Eiswasser gestellt haben (die Oligos in einem Röhrchen im Becherglas). Wir haben auch versucht, die Oligos in ein PCR-Gerät einzulegen, das alle 30 Sekunden um 5 Grad abkühlt. In Wirklichkeit macht die Methode keinen großen Unterschied. Wenn man sie zu lange bei hoher Temperatur belässt, könnte das zur Hydrolyse führen, daher vermeiden wir es, das Wasserbad einfach auszuschalten. Im Allgemeinen erhitzen wir die Oligos in einem Wasserbad in einem Becherglas auf 95 Grad, wobei sich das Oligoröhrchen in einem Eppendorf auf einem Schwimmständer befindet. Danach werden sie 10 Minuten in Eiswasser gelegt. Diese Methode scheint bei uns gut zu funktionieren, die anderen Methoden könnten jedoch bei Ihnen ebenfalls funktionieren.

Das Planen von Oligos mit Überhängen, durch die Stellen rekonstituiert werden, in die das Oligo eingefügt werden soll, kann schwierig sein. Im nachstehenden Diagramm ist ein Beispiel dafür aufgezeigt, wie die Oligos aussehen können. In diesem Beispiel sollen die Oligos an die Restriktionsstellen NcoI und XbaI ligiert werden.

Protokoll Hybridisieren von DNA-Oligos

Tipp: Oligo- und Primer-Stammlösungen werden häufig in Konzentrationen von 100 µM (100 Picomol/ul) resuspendiert.

1. 10 µl der Stammlösungs-Oligos (vorausgesetzt, es stehen zwei für die Hybridisierung zur Verfügung) zu 25 µl nukleasefreiem Wasser (Bestell-Nr. W4502) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben.
2. 5 µl Restriktionsverdaupuffer (z. B. 100 mM NaCl (Bestell-Nr. S3014), 50 mM  Tris-HCl (Bestell-Nr. 93362), 10 mM MgCl₂ (Bestell-Nr M0250), 1 mM Dithiothreitol (Bestell-Nr. D0632), pH 7,9 hinzufügen. Die Gegenwart des Puffers trägt dazu bei, dass der pH-Wert für die Stabilität der DNA richtig ist, und das Salz soll die Hybridisierung fördern. Die Oligokonzentration liegt jetzt bei 20 Pikomol/ul.
3. Das Röhrchen in einem Becherglas 5 Minuten in auf 95 Grad vorgewärmtem Wasser schwimmen lassen.
4. Das Becherglas in eine mit Eis und Wasser gefüllte Eisbox stellen, damit es 10 Minuten lang abkühlen kann.
5. Sobald das Wasser im Becherglas abgekühlt ist, die Oligos 10-fach und 100-fach in Wasser verdünnen und 1 µl davon zu einer Standard 20-µl-Ligationsreaktion hinzufügen. Es erscheint zunächst vorteilhaft, mehr hinzuzufügen, dadurch wird die Ligase jedoch nur von den Enden des Vektors auf die zusätzlichen Oligos wegtitriert, wodurch die Ligationseffizienz verringert werden kann. Die Endkonzentration der Oligos in der Ligation würde etwa 2 oder 0,2 Picomol/µl betragen. Dies ist immer noch ein erheblicher Überschuss an zu vektorisierenden Oligos.

Anfügen von 5'-Phosphaten an die DNA

Die T4-DNA-Ligase benötigt ein 5'-Phosphat auf einem der zu ligierenden DNA-Moleküle, um an die DNA anzubinden. Aus diesem Grund ist es oft notwendig, das DNA-Molekül zu phosphorylieren, bevor es zur Ligation hinzugefügt wird, z. B. bei der Blunt-End-Klonierung eines PCR-Produkts.

DNA-Phosphorylierungsprotokoll

Nukleasefreies Wasser (Bestell-Nr. W4502): 4.5 ul
PCR-Produkt oder andere DNA (aufgereinigt): 4 ul (wenn das PCR-Produkt 5' vertiefte oder stumpfe Enden hat, 5 Minuten auf 70 °C erwärmen und vor dem Hinzufügen zur Reaktion auf Eis abkühlen)
10 x T4 DNA-Ligase-Puffer: 1 ul (Ligasepuffer wird verwendet, weil er ATP enthält)
T4 Polynukleotidkinase: 0,5 ul

Die Kinasereaktion(en) 30 Minuten bei 37 °C inkubieren. Das phosphorylierte PCR-Produkt kann danach direkt ohne Aufreinigung in einer Ligationsreaktion eingesetzt werden (z. B. bei der Durchführung ortsspezifischer Mutagenese). Wenn das PCR-Produkt in einen de-phosphorylierten Vektor ligiert werden soll, kann es sinnvoll sein, das PNK-Enzym durch Hitze zu inaktivieren, um zu verhindern, dass es den Backbone-Vektor phosphoryliert und zu einem starken Hintergrundrauschen führt. Dies wird durch eine 20-minütige Inkubation der Reaktion(en) bei 65 °C erreicht.

Dephosphorylierung von DNA

Durch die Dephosphorylierung des Vektors soll verhindert werden, dass er während des Ligationsschritts in sich selbst zurückligiert, indem die 5'-Phosphatgruppen entfernt werden, die von der DNA-Ligase benötigt werden, um das Phosphodiester DNA-Grundgerüst miteinander zu verbinden. Es gibt verschiedene alkalische Phosphatasen, darunter Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIP), Krabbenphosphatase und antarktische Phosphatase. CIP (Bestell-Nr. P4978) ist das gebräuchlichste, es lässt sich jedoch nur schwer durch Hitze inaktivieren. Temperatur und Puffer der verschiedenen Enzyme können verschieden sein, siehe Anweisungen des Herstellers.

DNA-Dephosphorylierungsprotokoll für die Dephosphorylierung von DNA in einer Restriktionsverdaureaktion

50-100 µl DNA (5 µg) in einer Restriktionsverdaureaktion/-lösung
1-2 µl CIP-Enzym (1 Einheit/µl)

1. 1-2 µl CIP zum Restriktionsverdau hinzufügen. CIP ist in den meisten Restriktionsverdaupuffern stabil und aktiv.
2. Probe 30–60 Minuten bei 37 °C inkubieren.

DNA-Dephosphorylierungsprotokoll für die Dephosphorylierung von DNA in TE oder H₂O

20-40 µl DNA (5 µg) in TE (Bestell-Nr. T9285) oder nukleasefreies H₂O (Bestell-Nr. W4502)
5 µl 10xCIP-Puffer
1-2 µl CIP-Enzym (1 Einheit/µl)
Auffüllen auf 50 µl

1. Die DNA in ein steriles 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen geben, dann den CIP-Puffer und anschließend 1-2 µl CIP zugeben.
2. Mit einer Pipettenspitze gründlich mischen und 30-60 Minuten bei 37 °C inkubieren.

Tipp 1: Sicherstellen, dass das Fragment, das in den dephosphorylierten Vektor ligiert werden soll, 5'-Phosphatgruppen besitzt. Standard-Oligos/Primer und PCR-Produkte sind im Allgemeinen nicht phosphoryliert und müssen mit T4-Polynukleotidkinase behandelt werden (siehe Phosphorylierung von 5'-Enden). In der Regel ist es einfacher, Restriktionsstellen an die Enden eines PCR-Produkts anzuhängen (plus ein paar zusätzliche Basenpaare an den Enden), als ein Fragment zu phosphorylieren.

Tipp 2: CIP wird aus Stabilitätsgründen in einem Glycerinpuffer gelagert, was jedoch bedeutet, dass es in wässrigen Lösungen auf den Boden sinkt. Achten Sie bei der Zugabe des CIP darauf, dass es in das DNA-Gemisch fällt, indem Sie das Röhrchen vor sich halten, und stellen Sie sicher, dass es vor der Inkubation ordnungsgemäß resuspendiert wird.

DNA-Blunt-End-Klonierungsprotokolle

Manchmal ist es zum Beispiel notwendig, die Enden eines DNA-Moleküls zu glätten, z. B.:

• Bei der Herstellung einer DNA-Bibliothek
• Bei gescherter DNA mit ausgefransten Enden, die in einen Vektor kloniert werden müssen

Wenn die Auswahl kompatibler Restriktionsstellen nicht möglich ist, müssen der Vektor und das Insert oder beide vor der Ligation geglättet werden (dies kann ein letzter Ausweg sein). Es gibt zwei Möglichkeiten: entweder die Verwendung einer DNA-Polymerase (wie Klenow oder T4) oder eine Mungobohnen-Nuklease. Sowohl die Klenow- als auch die T4-DNA-Polymerase füllen 5'-Überhänge auf und bauen 3'-Überhänge ab. Wenn ein 5'-Überhang aufgefüllt werden muss, sind beide Enzyme geeignet. Wenn jedoch ein 3'-Überhang abgebaut werden muss, ist T4 möglicherweise die bessere Wahl, da es eine stärkere 3'-5'-Exonukleaseaktivität besitzt. Die Mungobohnen-Nuklease baut sowohl 5'- als auch 3'-Überhänge ab.

Protokoll Klenow-Abstumpfung

1. Die DNA soll in 1x Restriktionsverdaupuffer oder T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer, der mit je 33 μM dNTP [Endkonzentration] supplementiert ist, gelöst werden.
2. 1 Einheit Klenow pro Mikrogramm DNA hinzufügen und 15 Minuten bei 25 °C inkubieren.
3. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA in eine Endkonzentration von 10 mM und anschließendes Erhitzen bei 75 °C für 20 Minuten gestoppt.

T4-Abstumpfungsmethode

1. Die DNA soll in 1x-Restriktionsverdaupuffer gelöst und mit 100 µM dNTP [final] ergänzt werden.
2. 1 Einheit T4-DNA-Polymerase pro Mikrogramm DNA hinzufügen und 15 Minuten bei 12 °C inkubieren.
3. Die Reaktion durch Zugabe von EDTA in eine Endkonzentration von 10 mM und Erwärmen auf 75 °C für 20 Minuten stoppen.

Abstumpfungsmethode Mungobohnen-Nuklease

1. DNA (0,1 μg/μl) in 1X Mungobohnen-Nukleasepuffer oder einem Restriktionsenzympuffer suspendieren
2. 1,0 Einheiten Mungobohnen-Nuklease pro μg DNA hinzufügen.
3. Bei 30 °C 30 Minuten inkubieren.

NICHT versuchen, die Mungobohnen-Nuklease durch Hitze zu inaktivieren, da einzelsträngige DNA-Bereiche auftreten können, bevor das Enzym inaktiviert ist, was zu einem unbeabsichtigten Abbau führt. Das Enzym durch Spin-Säulen-Aufreinigung oder durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung inaktivieren.

DNA-Ligationsprotokoll

Während des Klonierungsvorgangs führen alle Wege zur Ligation und alle Schritte, die ihr vorausgehen, können ihre Effizienz erheblich beeinflussen. Es ist wichtig, vor der Ligationsreaktion die Tipps und Hinweise in jedem Beitrag zu lesen.

Die Ligationsreaktionen werden zusammen mit den Kontrollen aufgesetzt. In der Regel gibt es zwei Kontrollen:

• Der Vektor allein ohne Ligase (Kontrollen für ungeschnittenen Vektor)
• Der Vektor mit Ligase (kontrolliert eine unzureichende Dephosphorylierung, wenn er in Verbindung mit Kontrolle 1 verwendet wird)
• Die eigentliche Ligation, die aus Vektor + Fragment + Ligase besteht.

Wenn Sie auf Kontrolle 1 Kolonien erhalten haben, hat Ihr Restriktionsverdau des Vektors nicht funktioniert, da Sie auch ohne Ligase Kolonien erhalten haben. Wenn Sie bei Kontrolle 2 Kolonien bekommen haben, bei Kontrolle 1 aber nicht, hat die Behandlung mit alkalischer Phosphatase nicht funktioniert. Das liegt daran, dass der Verdau gut funktioniert hat (keine Kolonien auf Kontrolle 1) aber die Ligase das Plasmid rezirkulieren konnte, weil die 5'-Phosphate während der Dephosphorylierung nicht entfernt wurden. Wenn Kolonien auf 3 und keine (oder nur wenige) auf 1 und 2 vorliegen, wurde der maximale Erfolg erzielt.

Die Reaktionsbedingungen können von Labor zu Labor variieren. Die besten Ergebnisse werden bei 16 °C über Nacht erzielt, was jedoch bedeutet, dass der gesamte Prozess um einen Tag verlängert werden muss (sodass der Klonierungszyklus 4 Tage dauert). Die Durchführung einer Ligation bei Raumtemperatur über 1-2 Stunden führt in der Regel zu guten Ergebnissen und verkürzt die Klonierung für einen vollständigen Zyklus auf 3 Tage. Vorausgesetzt, es wird ein langer erster Tag eingeplant.

Die beiden schwierigsten Ligationsarten sind die Ligation von PCR-Produkten und die Ligation von stumpfen Enden. Es ist davon auszugehen, dass diese weniger effizient als die Standard-Klonierung eines Fragments von einem Vektor in einen anderen sind.

Eine typische Reaktion könnte wie folgt aussehen:

Probe	Vektor	Fragment	10X Ligasepuffer	Ligase (1U/µl)	Wasser
Ligation	1 µl	3 µl	2 µl	1 µl	13 µl
Kontrolle 1	1 µl	–	2 µl	1 µl	16 µl
Kontrolle 2	1 µl	–	2 µl	–	17 µl

1. Mit dem Aufbau der Reaktion beginnen, indem die Komponenten hinzugefügt werden, die für alle Reaktionen gleich sind, d. h. in jedes der Röhrchen zunächst das Wasser, dann den Puffer und schließlich den Vektor zugeben.
2. Danach das Fragment in das Ligationsröhrchen geben.
3. Abschließend die Ligase in das Ligationsröhrchen und das richtige Kontrollröhrchen geben. Die Reaktion nicht vortexen, da die DNA-Ligase scherempfindlich ist. Stattdessen mit der Spitze mischen, mit der die Ligase zugegeben wurde, gut umrühren und/oder mehrmals mit dem Finger auf das Röhrchen klopfen.
4. Entweder 1-2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 16 °C über Nacht inkubieren. Einige Laboranten hitzeinaktivieren die Ligation 20 Minuten bei 65 °C, das ist jedoch nicht unbedingt notwendig.
5. Sobald die Ligation abgeschlossen ist, das Plasmid einsetzen, um Bakterien zu transformieren, sodass das Protein entweder direkt exprimiert oder viele Kopien der Plasmid-DNA zur weiteren Verwendung gezüchtet werden können.

Tipp 1: Das BSA im Ligasepuffer kann beim Auftauen ausfällen, sichtbar als weißer Niederschlag am Boden des Puffers. Durch Vortexen und kurzzeitiges Erwärmen zwischen den Fingern oder bei 37 °C resuspendieren.

Tipp 2: Der Ligasepuffer enthält ATP, das nach mehreren Gefrier- und Auftauzyklen abgebaut wird. Die Puffervorräte in kleinen Aliquoten aufbewahren und diese nach > 3 Zyklen wegwerfen.

Tipp 3: Die Ligation (vor der Zugabe des Enzyms) einige Minuten auf 37 °C erwärmen, um die klebrigen Enden zu öffnen, oder bei der Linearisierung transient rezirkularisierter Vektoren unterstützen, wenn Ligationen mit einer einzelnen Restriktionsstelle eingesetzt werden. Die Ligation auf Raumtemperatur abkühlen, bevor das Enzym hinzugefügt wird, damit die Ligase beim Hinzufügen nicht beschädigt wird. Wir machen das nicht, aber wir haben uns sagen lassen, dass es helfen kann.

Tipp 4: Die Behandlung von PCR-Produkten mit Proteinase K vor der Ligation soll bei der Ligation helfen. Eine Gelextraktion des PCR-Produkts würde dies überflüssig machen, ebenso wie die Verwendung eines PCR-Clean-up-Kits zur Aufreinigung des Produkts.

Tipp 5: Unbedingt vermeiden, die DNA bei der Extraktion aus einem Gel UV-Strahlen auszusetzen. Dadurch kann die Ligationsleistung in einigen Fällen drastisch reduziert werden.

Tipp 6: Die Verwendung von mehr als 20-30 % des gesamten Ligationsvolumens (üblicherweise beträgt das Gesamtvolumen 20 μl) des aus Gel aufgereinigten Materials vermeiden. Wenn mehr verwendet wird, können zu viel Salz und andere Verunreinigungen in der Reaktion vorhanden sein und die Ligationsleistung kann sich entsprechend verringern.

Tipp 7: Die Vektormenge sollte kaum sichtbar sein, wenn sie auf einem Agarosegel laufen soll, also etwa 20-30 Nanogramm. Die Fragmente sollten reichlicher vorhanden sein, aber nicht mehr als in 5-10-facher Konzentration im Vergleich zum Vektor. Normalerweise verwenden wir ein Vektor-Fragment-Verhältnis von 1:2 oder 1:3.

Berechnung des Verhältnisses zwischen Insert und Vektor

Das molare Verhältnis zwischen Insert und Vektor kann sich erheblich auf das Ergebnis einer Ligation und die nachfolgenden Transformationsschritte auswirken. Die molaren Verhältnisse können von einem 1:1-Verhältnis zwischen Insert und Vektor bis zu einem Verhältnis von 10:1 reichen. Es kann erforderlich sein, mehrere Verhältnisse parallel zu testen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. In der nachstehenden Berechnung wird die Menge des Fragments im Verhältnis zum Vektor bei einem Verhältnis von 6:1 (Fragment:Vektor) aufgezeigt. Die 3 kann beliebig geändert werden, um alternative Konzentrationen zu berechnen.

Protokoll ortsspezifische Mutagenese

Die ortsspezifische Mutagenese (Site Directed Mutagenesis, SDM) ist eine nützliche Technik zur Einführung einer spezifischen Mutation an einer bestimmten Stelle in ein Plasmid. Die Mutation kann eine Substitution, Insertion oder Deletion sein. Es gibt viele Anwendungsmöglichkeiten für SDM, z. B. zur Bewertung der Funktion bestimmter Aminosäuren in einem Enzym, zur Untersuchung der Auswirkungen einer Veränderung der Basen in einem Promoter oder zur Entfernung von Restriktionsstellen aus einem Plasmid.

In diesem Beitrag wird eine PCR-basierte Methode der ortsspezifischen Mutagenese beschrieben. Das Grundprinzip besteht darin, ein Paar PCR-Primer unmittelbar aufeinanderfolgend zu definieren, sodass das gesamte Plasmid durch PCR amplifiziert wird. Einer dieser Primer enthält die gewünschte Mutation. Bei der PCR entsteht ein lineares Produkt, dessen Enden dann (nach Phosphorylierung) mit DNA-Ligase zusammengefügt werden können. Der zirkularisierte Vektor wird in E. coli transformiert.

Schritt 1: Mutageneseprozess und Primerdesign

Ein Primerpaar entwerfen, bei dem die gewünschte Mutation in das 5'-Ende eines der Primer eingebaut wird. Das Design so planen, dass der komplementäre Bereich eine Tm von etwa 60 °C hat.

Beispiel:

Bitte beachten Sie, dass nur der Vorwärtsprimer die Mutation enthält. Sie können also leicht eine Reihe verschiedener Mutationen erzeugen, indem Sie den Rückwärtsprimer gleich lassen, aber verschiedene Vorwärtsprimer verwenden. Bei dem obigen Beispiel handelt es sich um eine Substitution von 3 bp, eine Insertion kann jedoch auch auf die gleiche Weise erfolgen. Wenn eine sehr große Substitution oder Insertion benötigt wird, können mutierte Basen am 5'-Ende beider Primer eingefügt werden.

Deletionen jeder Größe können durch Einrichten eines Abstands der Vorwärts- und Rückwärtsprimer auf dem Template vorgenommen werden.

PCR-Primer haben aufgrund ihrer Syntheseart normalerweise keine Phosphatgruppe an ihrem 5'-Terminus. Das bedeutet, dass die Enden eines PCR-Produkts nicht einfach aneinander ligiert werden können, sondern zunächst phosphoryliert werden müssen. Hierfür gibt es im Wesentlichen zwei Möglichkeiten: 1) Die Primer können mit einem bereits an das 5'-Ende angefügten Phosphat bestellt werden oder 2) Das PCR-Produkt kann mit Polynukleotidkinase (PNK) phosphoryliert werden. Phosphorylierte Primer sind eine gute Idee, wenn nur wenige SDM durchgeführt werden und keine PNK im Gefrierschrank vorhanden sind (und es entfällt dadurch ein Arbeitsschritt). Die Verwendung von PNK ist kostengünstiger, wenn viele SDM durchgeführt werden (etwa 10 oder mehr).

Schritt 2: PCR

Es ist wichtig, eine Polymerase mit Korrekturlesefunktion zu verwenden, um das Einführen anderer Mutationen zu vermeiden. Falls Bedenken bezüglich der Einführung von Mutationen jedoch weiterhin ein Thema sind, kann das mutierte Fragment nach der Mutagenese in dasselbe Grundgerüst zurückkloniert werden.

Da die Methode auf PCR basiert, funktioniert sie bei kleineren Plasmiden besser. Befolgen Sie am besten die Anweisungen, die der Polymerase beiliegen, richten Sie jedoch eine PCR ähnlich wie in diesem Beispiel ein:

35.5 μl Wasser
5 μl 10x Polymerasepuffer
1,5 μl Vorwärtsprimer (0, 3 μM final)
1,5 μl Rückwärtsprimer (0,3 μM final)
5 ul dNTP (200 μM final)
1 ul Template-DNA (1:100-Verdünnung eines Mini-Preps)
0,5 μl Polymerase

Die Reaktion auf Eis einrichten und das Röhrchen unmittelbar nach dem Mischen der Reaktion in einen vorgewärmten PCR-Block überführen.

PCR-Programm:

1. 98 °C, 60 Sekunden
   
2. 98 °C, 8 Sekunden
   
3. 55-65 °C, 20 Sekunden
   
4. 72 °C (die Elongationszeit hängt von der Plasmidgröße und dem Typ der verwendeten Polymerase ab) Wiederholung/Zyklus der Schritte 2-4 weitere 27-30 mal
   5. 72 °C, 5 Minuten

Bei Raumtemperatur halten.

Schritt 3: Bereinigen des PCR-Produkts

Die gesamte Reaktion auf einem Agarosegel laufen lassen. Die Bande ausschneiden und die DNA mit einem Gel-Extraktionskit bei Eluieren in 30 μl aufreinigen.

Schritt 4: Phosphorylierung der 5'-Termini

*Dieser Schritt kann entfallen, wenn phosphorylierte Oligos in der PCR verwendet wurden.

4.5 μl nukleasefreies Wasser (Bestell-Nr. W4502)
PCR-Produkt
1 μl 10x T4 DNA-Ligase-Puffer*
0,5 μl T4-Polynukleotidkinase

Bei 37 °C 40 Minuten inkubieren.

*Der Ligasepuffer wird verwendet, weil er bereits ATP enthält und PNK darin aktiv ist.

Schritt 5: Ligation der DNA-Enden

Die Ligationsreaktion auf Eis einrichten.

6,7 μl nukleasefreies Wasser (Bestell-Nr. W4502)
2 μl PNK-Reaktion (aus Schritt 5)
0.8 μl 10x T4 DNA-Ligase-Puffer
0,5 μl T4-DNA-Ligase

Bei 16 °C über Nacht oder bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubieren.

Schritt 6: In kompetente E. coli transformieren

Schritt 7: Die Mutation durch DNA-Sequenzierung bestätigen