T7-Promoter-System

• Was ist die T7-Promotersequenz?
• Leistungsmerkmale des T7-Plasmid-Expressionssystems
• MAT™ Tag-Technologie
• Leitfaden für das T7-Promoter- und Expressionssystem

 Was ist die T7-Promotersequenz?

Der T7-Promoter ist eine DNA-Sequenz mit einer Länge von 18 Basenpaaren bis zur Transkriptionsstartstelle bei +1 (5' - TAATACGACTCACTATAG - 3'), die von der T7-RNA-Polymerase erkannt wird.¹ Der T7-Promoter wird in der Regel zur Regulierung der Genexpression rekombinanter Proteine verwendet, die anschließend für eine Vielzahl nachgeschalteter Forschungsanwendungen genutzt werden kann.²

 Leistungsmerkmale des T7-Plasmid-Expressionssystems

Bakterielle Vektoren auf der Basis des T7-Promoters ermöglichen die Expression, den Nachweis und die Aufreinigung rekombinanter FLAG^® und MAT™ (Metall-Affinitäts-Tag)-Fusionen in E. coli. Mehrere Vektoren, die den T7-Promoter enthalten, bieten duale Tag-Optionen für FLAG^® und MAT™ getaggte Fusionsproteine. Diese Vektoren verleihen Ampicillin-Resistenz für eine einfache Auswahl positiver Transformanten. Außerdem enthalten die Vektoren den T1T2-Transkriptionsterminator, den pMB1 (ein Derivat von pBR322)-Replikationsursprung , den f1-Ursprung und das lacI-Gen zur Unterdrückung des T7-Promoters.

pT7-FLAG^® und pT7-MAT™ Vektoren bieten den sehr starken T7/lac-Promoter. Mit diesen Expressionsvektoren lassen sich noch höhere Erträge rekombinanten Proteins erzielen als mit dem tac-Promoter-System. Der T7-Promoter ist jedoch dafür bekannt, dass er im Hintergrund ("leaky" (durchlässig)) exprimiert, was ein Nachteil sein kann, wenn rekombinante Proteine für die Wirtszelle toxisch sind. Daher enthalten unsere Vektoren die lac-Operator (lacO)-Sequenzen unmittelbar downstream vom Promoter, um die „leaky“ Expression zu verringern. Im Gegensatz zum tac-Promotersystem müssen pT7-Vektoren in Wirten exprimiert werden, die eine Quelle für die T7-Polymerase enthalten, wie z. B. lysogene (DE3)-Stämme.

 MAT™ Tag-Technologie

Das MAT™ Tag oder Metall-Affinitäts-Tag (HNHRHKH) wurde für die Aufreinigung rekombinanter MAT™ Fusionsproteine unter Verwendung von HIS-Select Nickel- und Kobalt-Affinitätsgelen entwickelt. HIS-Select-Produkte ermöglichen die hochselektive Aufreinigung von Histidin-markierten Fusionsproteinen wie MAT™ Fusionen. In vielen unserer neuesten Vektoren wird das MAT™ Tag eingesetzt, oft in Kombination mit dem bekannten FLAG^® Tag. MAT™ Tag-haltige Vektoren werden in Formaten für N-Terminus- oder C-Terminus-Markierung angeboten.

Abbildung 1. Kanamycin-Gen und Ampicillin-Gen für größere Selektionsflexibilität in E. coli

Literatur

1. Rong M, He B, McAllister WT, Durbin RK. 1998. Promoter specificity determinants of T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95(2):515-519. https://doi.org/10.1073/pnas.95.2.515

2. Komura R, Aoki W, Motone K, Satomura A, Ueda M. High-throughput evaluation of T7 promoter variants using biased randomization and DNA barcoding. PLoS ONE. 13(5):e0196905. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196905