Zellviabilitäts- und Zellproliferationsassays
- DNA-Synthese Proliferationsassays
- Metabolische Proliferationsassays
- Lumineszenzbasierte Assays zur Zellviabilität
- Fluoreszenzfarbstoff-Proliferationsassays
- 3D-Zellkultur – Dreifachfärbung von lebenden/toten/Gesamtzellen
- Trypanblau-Zellzählung
Einleitung
Assays für die Messung der Zellproliferation, Zellviabilität und Toxizität werden eingesetzt, um die Zellantwort und Zellgesundheit in Kulturen nach der Behandlung mit verschiedenen Stimuli zu überwachen. Die Wahl der geeigneten Assaymethode hängt von Anzahl und Typ der zu untersuchenden Zellen sowie vom erwarteten Ergebnis ab. Durch Zellproliferationsassays kann die Anzahl der Zellen im Zeitverlauf, die Anzahl der Zellteilungen, die Stoffwechselaktivität oder die DNA-Synthese überwacht werden. Durch die Zellzählung mit Farbstoffen zur Messung der Viabilität wie Trypanblau oder Calcein-AM kann sowohl die Proliferationsrate als auch der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen ermittelt werden.
Überblick Zellviabilitäts- und Zellproliferationsassays
DNA-Synthese Proliferationsassays
BrdU-Zellproliferationsassay
Die Zellproliferation kann durch Überwachung des Einbaus des Radioisotops [3H]-Thymidin in die zelluläre DNA und anschließende Autoradiographie untersucht werden. Alternativ kann anstelle von Thymidin auch 5-Brom-2′-Desoxy-Uridin (BrdU-Assays) verwendet werden. Zellen, die BrdU in ihre DNA eingebaut haben, lassen sich leicht mit einem monoklonalen Antikörper gegen BrdU und einem enzym- oder Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper nachweisen.
Abbildung 1.A, Proliferierende Zellen im Auge von E4-Hühnerembryonen mittels BrdU-Färbung B, Anti-BrdU-Antikörper-Validierung mit Camptothecin. Durch die Behandlung von Jurkat-Zellen mit Camptothecin, das den Zellzyklus unterbricht, werden zirkulierende Zellen am G1/S-Phasenübergang eingeschlossen.
EdU-Proliferationsassays
Baseclick EdU-Proliferationsassays sind eine effiziente Methode für den Fluoreszenznachweis replizierender DNA. Das modifizierte Nukleosid EdU wird lebenden Zellen zugesetzt und in die sich replizierende DNA eingebaut. Die Cu-induzierte Click-Chemie ermöglicht die schnelle Bindung von Fluoreszenzsonden an das EdU. Auf diese Weise lassen sich Zellen, die sich vermehren, quantitativ überwachen. Die Assays sind in verschiedenen Formaten für die mikroskopische Bildgebung, die Durchflusszytometrie, das Hochdurchsatz-Screening und für In-vivo-Versuche erhältlich. Vier verschiedene Fluoreszenzsonden mit einem Anregungsmaximum von 488, 555, 594 und 647 sind für die Multiplexfähigkeit mit anderen Fluoreszenzsonden erhältlich.
Abbildung 2.Edu-Click-Zellproliferationskits bauen EdU (5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin) während der aktiven DNA-Synthese in die DNA ein und werden mit einem Click-Chemie-Fluoreszenznachweisverfahren gemessen.
Metabolische Proliferationsassays
Assays, mit denen die Stoffwechselaktivität gemessen wird, eignen sich für die Analyse von Proliferation, Viabilität und Zytotoxizität. Die Reduktion von Tetrazoliumsalzen wie MTT, XTT und WST-1 zu farbigen Formazanverbindungen oder die Bioreduktion von Resazurin erfolgt nur in stoffwechselaktiven Zellen. Aktiv proliferierende Zellen erhöhen ihre Stoffwechselaktivität, während Zellen, die Toxinen ausgesetzt sind, eine geringere Aktivität aufweisen.
MTT-Zellproliferationsassays
MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid; Thiazolylblau) ist ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz, das eine gelbliche Lösung ergibt, wenn es in Medien oder Salzlösungen ohne Phenolrot hergestellt wird. Gelöstes MTT wird durch Spaltung des Tetrazoliumrings durch Dehydrogenase-Enzyme in ein unlösliches violettfarbenes Formazan umgewandelt. Dieses wasserunlösliche Formazan kann mit Isopropanol oder anderen Lösungsmitteln aufgelöst werden und das gelöste Material wird spektralphotometrisch gemessen, wobei die Absorbanz als Funktion der Konzentration des umgewandelten Farbstoffs eingesetzt wird.
XTT-Zellproliferationsassays
Im Gegensatz zu MTT ist das Spaltprodukt von XTT wasserlöslich; ein Solubilisierungsschritt ist daher nicht erforderlich. Das Tetrazoliumsalz XTT wird durch einen komplexen Zellmechanismus zu Formazan gespalten. Diese Bioreduktion findet ausschließlich in lebensfähigen Zellen statt und ist mit der NAD(P)H-Produktion durch Glykolyse verbunden. Die Menge des gebildeten Formazan-Farbstoffs korreliert direkt mit der Anzahl der stoffwechselaktiven Zellen in der Kultur.
WST-1 Zellproliferationsassays
Das stabile Tetrazoliumsalz WST-1 wird durch einen komplexen Zellmechanismus, der hauptsächlich an der Zelloberfläche abläuft, in ein lösliches Formazan gespalten. Diese Bioreduktion ist weitgehend abhängig von der glykolytischen Produktion von NAD(P)H in viablen Zellen. Die Menge des gebildeten Formazan-Farbstoffs korreliert direkt mit der Anzahl der stoffwechselaktiven Zellen in der Kultur.
Protokollleitfaden: WST-1 Assay für Zellviabilität und Zellproliferation. Protokolle, FAQ und Fehlerbehebung
Abbildung 3.Der MTT-Assay ist ein kolorimetrischer Assay zur Bewertung der Zellproliferation auf Basis der Stoffwechselaktivität. Die NAD(P)H-abhängigen zellulären Oxidoreduktase-Enzyme spiegeln die Anzahl der vorhandenen viablen Zellen wider. Diese Enzyme sind in der Lage, den gelben Tetrazoliumfarbstoff MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid zu seinem unlöslichen Formazan zu reduzieren, das eine violette Farbe hat.
Lumineszenzbasierte Assays zur Zellviabilität
Da ATP ein Indikator für stoffwechselaktive Zellen ist, kann die Anzahl der viablen Zellen anhand der verfügbaren ATP-Menge beurteilt werden. Der ATP Luciferase-Assay zur Zellviabilität ist ein hochempfindlicher, homogener Assay zur Quantifizierung von ATP in Zellkulturen. Dieses Kit nutzt die Leuchtkäfer-Luciferase zur Oxidation von D-Luciferin und die daraus resultierende Lichtproduktion, um die Menge an verfügbarem ATP in Zellkulturen zu bestimmen. Das empfindliche Assayverfahren umfasst die einmalige Zugabe eines ATP-Nachweiscocktails direkt zu Zellen, die in einem Serum-gesättigten Medium kultiviert werden. Es ist kein Waschen der Zellen, kein Entfernen des Mediums und kein mehrfaches Pipettieren erforderlich. Das Kit ist empfindlich genug für den Nachweis einer einzelnen Zelle oder von 0,01 Pikomol ATP. Das erzeugte Signal ist innerhalb von sechs Größenordnungen linear. Da die ATP-Menge mit der Anzahl der viablen Zellen in Beziehung gesetzt wird, bietet der Assay ein breites Anwendungsspektrum, das von der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen über die Zellproliferation bis hin zur Zellzytotoxizität reicht.
Abbildung 4.ATP-Biolumineszenz-Luciferase-Zellviabilitätsassay. Die Verwendung von ATP durch die Leuchtkäfer-Luciferase zur Oxidation von D-Luciferin und die daraus resultierende Lichterzeugung zur Ermittlung der verfügbaren ATP-Menge, die mit der Zellzahl und Viabilität korreliert.
Fluoreszenzfarbstoff-Proliferationsassays
CFSE-Kennzeichnung
5(6)-Carboxyfluorescein-Diacetat-N-Succinimidylester (CFSE) wird vorzugsweise zur Messung der Anzahl der Zellteilungszyklen in einer Zellpopulation verwendet. Nach dem Eindringen in die Zelle wird CFSE durch intrazelluläre Esterasen gespalten, um die fluoreszierende Verbindung zu bilden, und die Succinimidylestergruppe reagiert kovalent mit primären Aminen auf intrazelluläre Proteine. Bei Teilung halbiert sich die Fluoreszenzintensität jeder Tochterzelle, sodass die Anzahl der Zellteilungen mithilfe der Durchflusszytometrie einfach ermittelt werden kann. CFSE wird häufig zur Messung der Proliferation von Lymphozyten, einschließlich T-Zellen, verwendet.
Doppelfärbung lebender/toter Zellen
Doppelfärbung lebender/toter Zellen kann für den gleichzeitigen Fluoreszenznachweis von viablen und toten Zellen verwendet werden. /AT/deCalcein-AM ist ein hoch lipophiler und Zellmembran-durchlässiger Farbstoff. Obwohl /AT/deCalcein-AM selbst kein fluoreszierendes Molekül ist, emittiert das Calcein, das in einer viablen Zelle durch Esterase aus /AT/deCalcein-AM erzeugt wird, eine starke grüne Fluoreszenz (λex 490 nm, λem 515 nm). /AT/deCalcein-AM färbt daher ausschließlich viable Zellen. Im Gegensatz dazu ist der Kernfarbstoff Propidiumiodid nicht in der Lage, eine viable Zellmembran zu durchdringen. Er erreicht den Zellkern, indem er ungeordnete Bereiche der toten Zellmembran passiert, und interkaliert mit der DNA-Doppelhelix, um rote Fluoreszenz zu emittieren (λex 535 nm, λem 617 nm). Da sowohl Calcein als auch PI-DNA mit 490 nm Licht angeregt werden können, ist ein gleichzeitiges Monitoring von lebenden und toten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Einzelanregung möglich.
Abbildung 5.Doppelfärbung lebender/toter Zellen
3D-Zellkultur – Dreifachfärbung von lebenden/toten/Gesamtzellen
Das Bildgebungskit für die Zellviabilität ist ein Dreifarben-Assay, der mit 2D- und 3D-Zellkulturen für die gleichzeitige Fluoreszenzfärbung viabler Zellen (Calcein-AM), toter Zellen (Propidiumiodid/PI) sowie von Gesamtzellen (Hoechst 33342) verwendet werden kann.
- Calcein-AM fluoresziert bei der Bindung von Kalzium grün. Dies beruht auf der Esterase-Aktivität, die nur in metabolisch aktiven, viablen Zellen vorhanden ist.
- Propidiumiodid (PI) ist ein Kernfarbstoff, der von der Membran lebender Zellen ausgeschlossen wird, aber die beschädigte Membran toter Zellen durchdringt und mit der DNA interkaliert, um eine starke rote Fluoreszenz zu erzeugen.
- Hoechst 33342 ist ein DNA-Farbstoff, der eine geringe Zytotoxizität aufweist. Es fluoresziert blau und wird als Indikator für die Gesamtzellzahl verwendet.
Trypanblau-Zellzählung
Trypanblau ist eines von mehreren Färbemitteln, die für die Verwendung in Farbstoff-Ausschlusstests zur Zählung viabler Zellen empfohlen werden. Diese Methode beruht auf dem Prinzip, dass lebende (viable) Zellen den blauen Farbstoff nicht aufnehmen, tote (nicht viable) Zellen hingegen schon. Die Zellviabilität kann anhand des Verhältnisses von lebenden zu toten Zellen berechnet werden. Die Färbung erleichtert auch die Visualisierung der gesamten Zellmorphologie.
HINWEIS: Trypanblau hat eine größere Affinität zu Serumproteinen als zu zellulären Proteinen. Wenn der Hintergrund aufgrund von Serum in der Matrix zu dunkel ist, sollten die Zellen pelletiert und vor der Zählung in proteinfreiem Medium oder Salzlösung resuspendiert werden.
Literatur
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