Zellzählung mit einem Hämozytometer
Ziel
Für die meisten Manipulationen von Zelllinien, wie Transfektion, Zellfusionstechniken, Kryokonservierung und Subkulturroutinen, ist es erforderlich, die Anzahl der Zellen vor der Verwendung zu quantifizieren. Die Verwendung einer gleichbleibenden Zellanzahl sorgt für ein optimales Wachstum und trägt außerdem zur Standardisierung der Verfahren bei, in denen Zellkulturen eingesetzt werden. Dies wiederum führt zu Ergebnissen mit besserer Reproduzierbarkeit.
Materialien
- Zellkulturmedien: auf die richtige Temperatur vorgewärmt (siehe Datenblatt für die ECACC-Zelllinie bez. des richtigen Mediums und der richtigen Temperatur.)
- 70 % (v/v) Alkohol in sterilem Wasser (793213)
- Trypanblau-Lösung (T8154)
- 0,05 % Trypsin/EDTA in HBSS, ohne Ca2+/Mg2+ (T3924)
Ausrüstung
- Persönliche Schutzausrüstung (sterile Handschuhe, Laborkittel, Schutzvisier)
- Wasserbad auf geeignete Temperatur eingestellt
- Mikrobiologische Sicherheitswerkbank mit geeigneter Sicherheitsstufe
- Zentrifuge
- CO2 Inkubator
- Hämozytometer
- Invertiertes Phasenkontrastmikroskop
- Voretikettierte Fläschchen
Durchführung
- Adhärente und semiadhärente Zellen mit Trypsin/EDTA wie zuvor beschrieben in Suspension bringen und in einem Volumen an frischem Medium resuspendieren, das mindestens dem Trypsinvolumen entspricht. Zellen, die in Klumpen wachsen, zentrifugieren und in einem kleinen Volumen resuspendieren und vorsichtig pipettieren, um die Klumpen aufzubrechen.
- Unter sterilen Bedingungen 100-200 μl der Zellsuspension entnehmen.
- Ein gleiches Volumen Trypanblau (Verdünnungsfaktor = 2) hinzufügen und durch vorsichtiges Pipettieren mischen.
- Das Hämozytometer reinigen.
- Das Deckglas mit Wasser oder Atemluft befeuchten. Das Deckglas mit leichtem Druck über der Kammer hin und her schieben, bis die Newtonschen Ringe erscheinen (die Newtonschen Ringe sind als regenbogenförmige Ringe unter dem Deckglas zu erkennen).
- Beide Seiten der Kammer mit Zellsuspension füllen (ca. 5-10 μl) und unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop bei 20facher Vergrößerung betrachten.
- Die Anzahl der viablen (dargestellt als helle Zellen) und nicht viablen Zellen (blau gefärbt) zählen. Idealerweise sollen >100 Zellen gezählt werden, um die Genauigkeit der Zellzählung zu erhöhen (siehe Anmerkungen unten). Die Anzahl der gezählten Quadrate notieren, um eine Zählung >100 zu erhalten.
- Die Konzentration viabler und nicht viabler Zellen und den Prozentsatz viabler Zellen anhand der nachstehenden Gleichungen berechnen.
Wichtige Punkte
1. Trypanblau ist giftig und potenziell karzinogen. Es sollen Schutzkleidung, Handschuhe und Gesichts-/Augenschutz getragen werden. Die Dämpfe nicht einatmen.
2. Die zentrale Fläche der Zählkammer beträgt 1 mm2. Diese Fläche ist in 25 kleinere Quadrate(1/25 mm2) unterteilt. Jedes dieser Quadrate ist von drei Linien umgeben und wird dann in 16 weitere (1/400 mm2) unterteilt. Die Tiefe der Kammer beträgt 0,1 mm.
3. Durch den Korrekturfaktor von 104 werden 0,1 mm3 in 1 ml (0,1 mm3 = 1 mm2 x 0,1 mm konvertiert)
4. Es gibt mehrere Quellen für Ungenauigkeiten:
- Vorhandensein von Luftblasen und Ablagerungen in der Kammer
- Überfüllung der Kammer, sodass die Probe in die Kanäle oder in die andere Kammer läuft
- Unvollständige Befüllung der Kammer. Die Zellen sind nicht gleichmäßig in der Kammer verteilt.
- Zu wenige Zellen, um sie zu zählen. Dies kann durch Zentrifugieren der Zellen, erneutes Suspendieren in einem kleineren Volumen und erneutes Auszählen behoben werden
- Zu viele Zellen, um sie zu zählen. Dies kann durch Verwendung eines höheren Verdünnungsfaktors für Trypanblau, z. B. 1:10, vermieden werden
5. Die Verwendung eines Hämozytometers kann zeitaufwändig sein, unterliegt subjektiven Einschätzungen des Bedieners und einige Zelltypen, wie z. B. solche, die Cluster bilden, sind mit dieser Methode besonders schwer zu zählen. Es sind Geräte zur Zellzählung erhältlich, die alternative Methoden zur Zellquantifizierung bieten, darunter der Scepter™ Cell Counter. Der Muse® Cell Analyzer ermöglicht die durchflusszytometrische Bewertung von Zellzahl und Viabilität. Der Scepter™ Cell Counter ist ein tragbarer Handheld-Zellzähler, mit dem das Volumen nach dem Coulter-Prinzip gemessen wird. Mit dem Gerät können Zellen anhand ihrer Größe quantifiziert und größere Zellen von kleineren Trümmern unterschieden werden, im Gegensatz zu bildgebenden Verfahren, die auf Objekterkennungssoftware beruhen und mit denen kleine Zellen nicht zuverlässig erkannt werden können. Der Scepter™ Zellzähler erkennt jede Zelle und zeigt die Population als Histogramm der Zellgrößenverteilung an. Anhand des Histogramms werden entweder alle Zellen gezählt oder es wird die Gating-Funktion eingesetzt, um eine ausgewählte Teilpopulation zu zählen. Durch die Überwachung der Veränderungen in einem Histogramm kann ein Einblick in den Zustand und die Qualität einer Zellkultur von einem Versuch zum nächsten gewonnen werden.
Abbildung 1.Zellzählung mit Hämozytometer und Trypanblau Viable Zellen enthalten intakte Zellmembranen und nehmen kein Trypanblau auf; sie erscheinen im Hämozytometer hell/klar. Tote Zellen haben beschädigte Zellmembranen und nehmen Trypanblau auf; sie erscheinen im Hämozytometer blau. Die Viabilität der Zellen kann anhand des Verhältnisses von lebenden zu toten Zellen geschätzt werden.
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