Protokoll für das GenElute™-Kit für bakterielle genomische DNA
(NA2100, NA2110, NA2120)

Beschreibung für das GenElute™-Kit für bakterielle genomische DNA

Unser GenElute™-Kit für bakterielle genomische DNA bietet eine einfache und praktische Möglichkeit für die Isolation von reiner DNA aus verschiedenen kultivierten Bakterien. Das Kit enthält alle Reagenzien, die zum Isolieren und Aufreinigen von genomischer DNA aus gramnegativen Bakterien erforderlich sind. Für die meisten grampositiven Bakterien muss das Kit in Verbindung mit dem optionalen Lysozym (L4919) verwendet werden, um die dicken Peptidoglykanzellwände wirksam zu lysen. Eine grampositive Lyselösung wird als Verdünnungsmittel zur Herstellung der Lysozymstammlösungen bereitgestellt.

Das GenElute™-Kit kombiniert die Vorteile eines Systems auf Siliziumdioxidbasis mit einem Mikrospinformat und eliminiert die Notwendigkeit für teure Harze, Alkoholfällung und gefährliche organische Verbindungen wie Phenol und Chloroform. Die Bakterien werden in einer chaotropen salzhaltigen Lösung lysiert, um die gründliche Denaturierung von Makromolekülen sicherzustellen. Die Zugabe von Ethanol sorgt dafür, dass die DNA bindet, wenn das Lysat durch eine Siliziumdioxidmembran in ein Mikrozentrifugenröhrchen gesponnen wird. Nach dem Waschen zum Entfernen von Verunreinigungen wird die DNA in 200 μl einer Tris-EDTA-Lösung eluiert.

Die erwartete Ausbeute von genomischer DNA variiert abhängig von der Zelldichte der Bakterienkultur sowie der verwendeten Bakterienspezies und des Stamms. Anhang 2 listet die typische Ausbeute von genomischer DNA, die aus einigen gramnegativen und grampositiven Bakterien aufgereinigt wird. Mit dem GenElute™-Kit aufgereinigte DNA weist ein A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis von 1,6 bis 1,9 auf und kann bis zu 50 kb lang sein. Diese DNA für ist Downstream-Anwendungen wie Restriktionsendonukleaseverdau, PCR und Southern Blot bereit.

Bereitgestellte Reagenzien	Katalog- Nummer	NA2100 10 Aufbereitungen	NA2110 70 Aufbereitungen	NA2120 350 Aufbereitungen
Grampositive Lyselösung	L7539	3 ml	20 ml	90 ml
Lyselösung T	B6678	2,5 ml	20 ml	90 ml
Lyselösung C	B8803	2,5 ml	20 ml	90 ml
Waschlösung 1	W0263	7 ml	50 ml	225 ml
Waschlösungskonzentrat	B6553	2,5 ml	20 ml	90 ml
Elutionslösung (10 mmol/l Tris-HCl, 0,5 mmol/l EDTA, pH-Wert 9,0)	B6803	5 ml	35 ml	180 ml
Säulenvorbereitungslösung	C2112	7 ml	60 ml	225 ml
Proteinase K	P2308	1 x 5 mg	3 x 10 mg	2 x 100 mg
RNase A-Lösung	R6148	0,25 ml	1,7 ml	8 ml
GenElute-Nukleinsäurenbindungssäulen in Röhrchen	C9471	jeweils 10 Stück	jeweils 70 Stück	jeweils 5 x 70 Stück
Sammelröhrchen, Kapazität 2 ml	T5449 oder T7813	jeweils 3 x 10 Stück	jeweils 3 x 70 Stück	jeweils 15 x 70 Stück

Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Ausrüstung und Reagenzien

• 37-°C-Wasserbad oder Heizblock
• 55-°C-Wasserbad oder Heizblock
• Pipettenspitzen (Aerosolbarriere wird empfohlen)
• 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für die Lyse
• Mikrozentrifuge (2-ml-Röhrchen, mit Rotor)*
• Ethanol (95 %–100 %), Katalognr.: E7023, E7148 oder 459836
• Für die Molekularbiologie geeignetes Wasser, Katalognr.: W4502
• Lysozym, Katalognr.: L4919 (nur für grampositive Bakterien)
• Mutanolysin, Katalognr.: M9901 (nur für Streptococcus-Spezies)
• Lysostaphin, Katalognr.: L7386 (nur für Staphylococcus)

Hinweis: Um sicherzustellen, dass alle Röhrchen richtig sitzen, wird ein Rotor mit 24 Plätzen empfohlen. Wenn Sie einen Rotor mit 36 Plätzen verwenden, wird für einen richtigen Sitz der Röhrchen empfohlen, nur jeden zweiten Platz zu verwenden.

Lagerung und Haltbarkeit

Lagern Sie das Kit bei Raumtemperatur. Falls Reagenzien des Kits ausfällen, erwärmen Sie sie auf 55–65 °C, bis die Ausfällung gelöst ist und lassen Sie sie vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.

Aufbereitungsanleitung

1. Vorwärmen eines Wasserbads oder Heizblocks auf 55 °C
   Zur Verwendung mit sowohl grampositiven als auch gramnegativen Bakterien.  
   
   
2. Vorwärmen eines Wasserbads oder Heizblocks auf 37 °C
   Zur Verwendung nur mit grampositiven Bakterien.
    
3. Gründliches Mischen der Reagenzien
   Überprüfen Sie die Reagenzien auf Ausfällung. Falls Reagenzien ausfällen, erwärmen Sie sie auf 55–65 °C, bis die Ausfällung gelöst ist und lassen Sie sie vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.
    
   
4. Verdünnen des Waschlösungskonzentrats
   Verdünnen Sie das Konzentrat mit 10 ml (10-Aufbereitungen-Packung), 80 ml (70-Aufbereitungen-Packung) oder 360 ml (350-Aufbereitungen-Packung) 95–100 % Ethanol. Verschließen Sie die verdünnte Waschlösung nach jedem Gebrauch dicht, um eine Ethanolverdampfung zu verhindern.
    
5. Rekonstituieren von Proteinase K
   Lösen Sie das Pulver aus einer Flasche Proteinase K gemäß Tabelle 1 in Wasser, um eine 20-mg/ml-Stammlösung zu erhalten. Die Proteinase K-Lösung kann mehrere Tage bei 2–8 °C aufbewahrt werden. Für die Langzeitlagerung kann der nicht verwendete Teil der
   Lösung bis zum Gebrauch bei -20 °C in Aliquoten aufbewahrt werden. Dieses Produkt ist zum Zeitpunkt der Lieferung bei Raumtemperatur stabil.
   
   Hinweis: Die Proteinase K-Lösung muss jedes Mal direkt zu jeder Probe gegeben werden. Kombinieren Sie die Proteinase K-Lösung für die Lagerung nicht mit der Lyselösung.

Tabelle 1 Herstellung der Proteinase K-Lösung

Katalog- Nummer	Proteinase K	Wasser
NA2100	5 mg	0,25 ml
NA2110	10 mg	0,5 ml
NA2120	100 mg	5,0 ml

6.  Herstellen der Lysozymlösung (nur für grampositive Bakterien)
   Stellen Sie mit der enthaltenen grampositiven Lyselösung (L7539) als Verdünnungsmittel eine 2,115 × 106-Einheiten/ml-Stammlösung Lysozym (L4919) her (etwa 45 mg/ml). Um beispielsweise 1 ml Lysozymlösung herzustellen, lösen Sie 2,115 x 106 Einheiten Lysozym in 1 ml grampositiver Lyselösung.
   
   Pipettieren Sie die Mischung hoch und runter oder vortexen Sie sie, um das Lysozym zu lösen (siehe nachstehenden Hinweis). Für jede durchzuführende DNA-Aufbereitung werden 200 µl Lysozymlösung benötigt. Stellen Sie für den Fall möglicher Pipettierfehler mehr Lösung her als Sie benötigen.  Die Lysozymlösung sollte noch am Tag ihrer Herstellung verbraucht werden.
   
   Hinweis: Durch hoch und runter Pipettieren lässt sich das Lysozym leichter lösen als durch Vortexen. Übermäßiges Vortexen kann zu Schaumbildung führen. Eventuell lässt sich das Lysozym nicht leicht lösen. In diesem Fall muss es vor dem Gebrauch nicht vollständig gelöst sein. Die Ausbeuten von genomischer DNA werden dadurch nicht beeinträchtigt, da das Lysozym während der Inkubation bei 37 °C gelöst wird.

 

Verfahren

Falls für Downstream-Anwendungen minimal gescherte DNA gewünscht wird, z. B. wenn das Endprodukt für lange PCR-Amplifikation eingesetzt wird, mischen Sie im folgenden Verfahren statt durch Vortexen durch vorsichtiges Pipettieren oder Umdrehen bis zur Homogenität. Siehe Anhang 1 für eine Umwandlung der g-Kraft in Umdrehungen pro Minute (RPM).

A. Aufbereitung von gramnegativen Bakterien

1a. Zellernte
Erzeugen Sie 1,5 ml Rückstand einer Übernachtkulturbrühe von Bakterien, indem Sie sie 2 Minuten bei 12.000 bis 16.000 × g zentrifugieren. Entfernen Sie das Kulturmedium vollständig und entsorgen Sie es.
Hinweis: Falls Sie Bakterien in nährstoffreichen Medien wie Terrific Broth (T9179) züchten, ist es erforderlich, das Volumen des Ausgangsmaterials einer Übernachtkulturbrühe von Bakterien auf 0,5 ml zu reduzieren, um eine Überladung der GenElute™-Säulen zu verhindern. Weitere Informationen entnehmen Sie bitte Anhang 2.

2a. Zellen resuspendieren
Resuspendieren Sie den Rückstand gründlich in 180 μl Lyselösung T/Puffer STL für das GenElute™-Kit für genomische Säugetier-DNA (B6678). Falls Rest-RNA kein Problem darstellt, fahren Sie mit Schritt 3a fort.
Optionale Behandlung mit RNase A: Falls RNA-freie DNA erforderlich ist, geben Sie 20 μl RNase A-Lösung (R6148) zu, mischen Sie und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie anschließend mit Schritt 3a fort.

3a. Vorbereitung für die Zelllyse
Geben Sie 20 μl Proteinase-K-Lösung zu der Probe. Mischen und inkubieren Sie für 30 Minuten bei 55 °C.

4a. Zelllyse
Geben Sie 200 μl Lyselösung C (B8803) zu, vortexen Sie gründlich (etwa 15 Sekunden) und inkubieren Sie bei 55 °C für 10 Minuten.
Eine homogene Mischung ist essenziell für eine effiziente Lyse.
Fahren Sie mit Schritt 5 fort.

B. Aufbereitung von grampositiven Bakterien

1b. Herstellen der Lysozymlösung mit Lysozym aus Hühnereiklar (L4919)
Stellen Sie wie unter Aufbereitungsanleitung beschrieben eine Lysozymstammlösung mit 2,115 x 106 Einheiten/ml her. Für jede durchzuführende DNA-Aufbereitung werden 200 µl Lysozymlösung benötigt. Stellen Sie für den Fall möglicher Pipettierfehler mehr Lösung her als Sie benötigen.
Hinweis: Falls Sie mit Staphylococcus-Spezies arbeiten, ergänzen Sie die Lysozymlösung mit 200 Einheiten/ml Lysostaphin (L7386). Falls Sie mit Streptococcus-Spezies arbeiten, ergänzen Sie die Lysozymlösung mit 250 Einheiten/ml Mutanolysin (M9901).

2b. Zellernte
Erzeugen Sie 1,5 ml Rückstand einer Übernachtkulturbrühe von Bakterien, indem Sie sie 2 Minuten bei 12.000 bis 16.000 × g zentrifugieren. Entfernen Sie das Kulturmedium vollständig und entsorgen Sie es.
Hinweis: Falls Sie Bakterien in nährstoffreichen Medien wie Terrific Broth (T9179) züchten, ist es erforderlich, das Volumen des Ausgangsmaterials einer Übernachtkulturbrühe von Bakterien auf 0,5 ml zu reduzieren, um eine Überladung der GenElute™-Säulen zu verhindern. Weitere Informationen entnehmen Sie bitte Anhang 2.

 

3b. Zellen resuspendieren
Resuspendieren Sie den Rückstand gründlich in 200 μl Lysozymlösung (hergestellt in Schritt 1b) und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten.
Optionale Behandlung mit RNase A: Falls restliche RNA kein Problem darstellt, fahren Sie mit Schritt 4b fort. Falls RNA-freie genomische DNA erforderlich ist, geben Sie 20 μl RNase-A-Lösung zu und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie anschließend mit Schritt 4b fort.

4b. Zelllyse
Geben Sie 20 μl Proteinase-K-Lösung, gefolgt von 200 μl Lyselösung C (B8803) zu der Probe. Vortexen Sie gründlich (etwa 15 Sekunden) und inkubieren Sie bei 55 °C für 10 Minuten. Eine homogene Mischung ist essenziell für eine effiziente Lyse. Fahren Sie mit Schritt 5 fort.

Isolation von DNA aus grampositiven und gramnegativen Bakterien
Dies ist eine Fortführung des Verfahrens für Lysate, die in Schritten 1 bis 4a und/oder Schritten 1 bis 4b hergestellt wurden.

5. Säulenvorbereitung
Geben Sie 500 μl der Säulenvorbereitungslösung zu jeder vormontierten GenElute™-Miniprep-Bindungssäule (mit einem roten O-Ring; nicht zu verwechseln mit anderen GenElute™-Kits), die sich in einem 2-ml-Sammelröhrchen befindet. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 1 Minute. Entsorgen Sie das Eluat.
Hinweis: Die Säulenvorbereitungslösung maximiert die Bindung von DNA an die Membran, wodurch konsistentere Ausbeuten erzielt werden.

6. Vorbereitung für die Bindung
Geben Sie 200 µl Ethanol (95–100 %) zu dem Lysat und mischen Sie gründlich durch Vortexen für 5–10 Sekunden. Eine homogene Mischung ist essenziell.

7. Lysat beladen
Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Röhrchens in die Bindungssäule. Nutzen Sie eine Pipettenspitze mit breiter Öffnung, um Scherkräfte auf die DNA beim Übertragen des Inhalts in die Säule zu reduzieren. Zentrifugieren Sie bei ≥ 6.500 × g für 1 Minute. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen mit dem Eluat und geben Sie die Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen.

8. Erstes Waschen
Geben Sie 500 µl Waschlösung 1 (W0263) zu der Säule und zentrifugieren Sie bei ≥ 6.500 × g für 1 Minute. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen mit dem Eluat und geben Sie die Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen.

9. Zweites Waschen (Wichtiger Hinweis: Überprüfen Sie, dass Ethanol zu der Flasche mit Waschlösungskonzentrat gegeben wurde.)
Geben Sie 500 µl Waschlösung zu der Säule und zentrifugieren Sie für 3 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (12.000–16.000 × g), um die Säule zu trocknen. Die Säule muss vor der Elution der DNA ethanolfrei sein.
Zentrifugieren Sie die Säule für 1 weitere Minute bei maximaler Geschwindigkeit, falls restliches Ethanol erkennbar ist. Sie können das Sammelröhrchen für diesen zusätzlichen Zentrifugierschritt leeren und wiederverwenden. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen mit dem Eluat schließlich und geben Sie die Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen.

10. DNA eluieren
Pipettieren Sie 200 µl der Elutionslösung (B6803) direkt in die Mitte der Säule. Zentrifugieren Sie bei ≥ 6.500 × g für 1 Minute, um die DNA zu eluieren. Um die Elutionseffizienz zu steigern, inkubieren Sie nach der Zugabe der Elutionslösung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie anschließend.
Optional: Durch das Wiederholen von Schritt 10 mit weiteren 200 µl Elutionslösung und Eluieren in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen oder in dasselbe 2-ml-Sammelröhrchen, das für das erste Eluat verwendet wurde, kann eine zweite Elution gesammelt werden. Die Ausbeute kann durch das Durchführen einer zweiten Elution um 20–50 % gesteigert werden.

Das Eluat enthält reine genomische DNA. Für die Kurzzeitlagerung von DNA werden 2–8 °C empfohlen.
Für die Langzeitlagerung werden -20 °C empfohlen. Vermeiden Sie Einfrieren und Auftauen, da dies Brüche in dem DNA-Strang hervorruft. Die Elutionslösung hilft beim Stabilisieren der DNA bei diesen Temperaturen.

Abbildung 1. PFGE aus bakterieller gDNA, die mit dem GenElute™-Kit für bakterielle gDNA isoliert wurde.

Aufgereinigte genomische DNA wurde mit dem GenElute™-Kit für bakterielle genomische DNA aus verschiedenen Bakterienspezies isoliert. Ein 1-µg-Aliquot von DNA aus jeder entsprechenden Bakterienprobe wurde auf einem 1-%-Agarosegel in 0,5 X TBE bei 150 Volt für 16 Stunden mit einem BioRad CHEF DRII System getrennt. Die anfängliche Impulsdauer betrug 2 Sekunden, die abschließende Impulsdauer betrug 13 Sekunden. Das Anfangsverhältnis betrug 1,0. Die Pumpgeschwindigkeit wurde auf 70 eingestellt und PFGE wurde bei 4 °C durchgeführt. M steht für den Pulsmarker für 0,1–200 kb (Kat.-Nr. D2291).

Bahnen

1. E. coli
2. P. fluorescens
3. B. subtilis

Ergebnisse

Die Konzentration und Qualität der genomischen Dann kann durch spektrophotometrische Analyse und Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden. Verdünnen Sie die DNA in TE-Puffer (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH-Wert 8,0–8,5) und messen Sie die Absorption bei 260 nm, 280 nm und 320 nm mit einer Quarz-Mikroküvette. Die Absorption bei 260 nm und 280 nm sollte zwischen 0,1 und 1,0 liegen (oder innerhalb des linearen Bereichs ihres Spektrophotometers). Die Absorption bei 320 nm wird verwendet, um die Hintergrundabsorption auszugleichen. Eine Absorption von 1,0 bei 260 nm entspricht etwa 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Das Verhältnis von A260–A320/A280–A320 sollte 1,6–1,9 betragen.
Die Größe und Qualität der DNA können durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden.¹ Ein Gel mit 0,8 % Agarose (A9539) in 0,5 X TBE-Puffer (T6400) eignet sich gut für die Trennung von genomischer DNA. Die DNA kann durch Färben mit einem interkalierenden Farbstoff wie Ethidiumbromid (E1510) visualisiert und gegen einen bekannten DNA-Marker wie Lambda-DNA-Hind III-Aufschluss (D9780) gemessen werden. Die genomische DNA sollte als einzelne Bande mit hoher Molekülmasse und sehr wenigen Hinweisen auf Scheren migrieren. Eine
genauere Bestimmung der Größe der DNA kann durch Pulsed-Field-Gelelektrophorese durchgeführt werden.²

Fehlerbehebung

Problemstellung	Ursache	Behebung
Das Lysozym ist schwer zu lösen	Die Lösung ist nicht ausreichend gemischt.	Pipettieren Sie sie hoch und runter, anstatt zu vortexen, um das Lysozym zu lösen. Übermäßiges Vortexen führt zu Schaumbildung und verringert die Löslichkeit des Lysozyms. Das Lysozym löst sich gegebenenfalls nicht leicht. Es muss vor dem Gebrauch nicht vollständig gelöst sein, da es sich während der Inkubation bei 37 °C löst.
Die Bindungssäule ist verstopft	Die Probe ist zu groß.	Verwenden Sie in Zukunft weniger Zellen (≥1 ×1010 Zellen/ml). Um die aktuelle Aufbereitung zu retten, steigern Sie die g-Kraft und/oder zentrifugieren Sie länger, bis das Lysat durch die Bindungssäule läuft. Die Ausbeute von genomischer DNA könnte verringert sein.
Das Lysat erscheint vor dem Beladen der Säule sehr gelartig.	Die Probe ist zu groß.	Verwenden Sie in Zukunft weniger Zellen (≥1 ×1010 Zellen/ml). Verlängern Sie die Inkubationszeit und/oder erhöhen Sie die Menge von Proteinase-K-Lösung (Schritt 3a) oder Lysozymlösung (Schritt 3b) abhängig davon, ob das gramnegative oder grampositive Verfahren durchgeführt wird. Verdoppeln Sie beispielsweise sowohl die Inkubationszeit als auch die Enzymmenge.
Die Ausbeute von genomischer DNA ist gering.	Die Probe ist alt.	Die Ausbeute variiert abhängig von verschiedenen Spezies und Stämmen von Bakterien. Es kann erforderlich sein, Bakterienkulturen zu verwenden, bevor sie ihre maximale Dichte erreichen oder vollständig konfluent werden.
	Die Zellen sind unzureichend lysiert.	Verlängern Sie die Inkubationszeit und/oder erhöhen Sie die Menge von Proteinase-K-Lösung (Schritt A3) oder Lysozymlösung (Schritt B3) abhängig davon, ob das gramnegative oder grampositive Verfahren durchgeführt wird. Verdoppeln Sie beispielsweise sowohl die Inkubationszeit als auch die Enzymmenge.
	Die Lysat-/Ethanolmischung ist nicht homogen.	Um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist, vortexen Sie sie für 5–10 Sekunden, bevor Sie sie zu der Bindungssäule geben. Falls für Downstream-Anwendungen minimal gescherte DNA gewünscht wird, z. B. wenn das Endprodukt für lange PCR-Amplifikation eingesetzt wird, mischen Sie statt durch Vortexen durch vorsichtiges Pipettieren oder Umdrehen bis zur Homogenität.
	Die DNA-Elution ist unvollständig.	Bestätigen Sie, dass die DNA in 200 µl Elutionslösung eluiert wurde. Die DNA-Ausbeute kann durch Inkubieren der Elutionslösung nach Zugabe zu der Säule für 5 Minuten bei Raumtemperatur gesteigert werden. Eine zweite und dritte Elution mit 200 µl Elutionslösung können durchgeführt werden.
	Ethnol wurde während der Bindung weggelassen.	Prüfen Sie, dass das Ethanol in Schritt 6 zugegeben wurde, bevor Sie die Probe in Schritt 7 in die Bindungssäule geben.
	Das Eluat enthält restliches Ethanol von dem Waschen.	Ethanol aus dem abschließenden Waschschritt muss entfernt werden, bevor die DNA eluiert wird. Zentrifugieren Sie länger oder ein zweites Mal, um die Membran zu trocknen. Falls ethanolhaltiges Eluat mit der Bindungssäule in Kontakt kommt, wiederholen Sie den Zentrifugierschritt vor der Elution der DNA.
	Das Waschlösungskonzentrat wurde vor dem Gebrauch nicht verdünnt.	Prüfen Sie, ob das Waschlösungskonzentrat vor dem Gebrauch korrekt mit Ethanol verdünnt wurde.
	Statt Elutionslösung wurde Wasser für die Elution verwendet.	Für eine optimale Ausbeute und Lagerung der aufgereinigten DNA wird die Elutionslösung empfohlen. Falls Wasser für die Elution verwendet wird, vergewissern Sie sich, dass der pH-Wert mindestens 7,0 beträgt, um saure Bedingungen zu vermeiden, da diese die DNA bei einer Langzeitlagerung einer Säurehydrolyse unterziehen könnten.
Die Reinheit der DNA ist geringer als erwartet; das Verhältnis von A260/A280 ist zu gering.	Die Probe wurde in Wasser verdünnt.	Verwenden Sie entweder Elutionslösung (10 mmol/l Tris-HCl, 0,5 mmol/l EDTA, pH-Wert 9,0) oder 10 mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 8,0–8,5 als Eluant.
	Der Messwert des Hintergrunds ist aufgrund von Siliziumdioxidfeinteilen hoch.	Zentrifugieren Sie die DNA-Probe 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit. Verwenden Sie den Überstand, um die Absorptionsmessungen zu wiederholen.
Die Reinheit der DNA ist geringer als erwartet; das Verhältnis von A260/A280 ist zu hoch.	Die genomische DNA ist mit RNA kontaminiert.	Künftige Isolationen sollten einen Behandlungsschritt mit RNase A einschließen, oder das Endprodukt sollte mit RNase-A-Lösung behandelt und erneut aufgereinigt werden. Es kann erforderlich sein, die Inkubationszeit mit RNase A in Schritten A2 und B3 zu verlängern, um die restliche RNA vollständig aufzuschließen.
Die DNA ist geschert.	Die genomische DNA wurde unsachgemäß gehandhabt.	Dieses Kit wurde zum Entfernen von DNA-Ausfällung und -Resuspension konzipiert. Dies sind gängige Schritte, die in anderen Kits für genomische DNA vorkommen und zu scheren führen können. Alle Pipettierschritte sollten so behutsam wie möglich durchgeführt werden. Pipettenspitzen mit breiter Öffnung werden empfohlen, um scheren zu eliminieren. Falls für Downstream-Anwendungen minimal gescherte DNA gewünscht wird, z. B. wenn das Endprodukt für lange PCR-Amplifikation eingesetzt wird, mischen Sie statt durch Vortexen durch vorsichtiges Pipettieren oder Umdrehen bis zur Homogenität.
	Die Zellen sind alt.	Kulturen, die über einen langen Zeitraum kultiviert werden, können vorzeitig lysieren, wenn die Zellwand Lyseenzymen ausgesetzt wird, was zur Freisetzung der endogenen Nukleasen und der anschließenden Zersetzung von DNA führt. Starten Sie mit frischen Kulturen. Downstream-Anwendungen werden gehemmt.
	Ethanol wird in die endgültige genomische DNA-Aufbereitung übertragen.	Lassen Sie das Eluat nach dem abschließenden Waschen der Bindungssäule (Schritt 9) nicht mit der Säule in Kontakt kommen. Zentrifugieren Sie die Säule falls nötig erneut für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit (12.000–16.000 × g), nachdem Sie das Sammelröhrchen entleert haben.
	Salz wird in die endgültige genomische DNA-Aufbereitung übertragen.	Stellen Sie sicher, dass die Bindungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen gegeben wird, bevor Sie in Schritten 8 und 9 die Waschlösungen zugeben.

Anhang 1

Hinweis: Alle Zentrifugiergeschwindigkeiten werden in g-Einheiten angegeben. Bitte beziehen Sie sich für Informationen zur Umrechnung der g-Kraft in Umdrehungen pro Minute (RPM) auf Tabelle 2. Wenn die für die erforderlichen g-Kräfte benötigten Zentrifugen/Rotoren nicht verfügbar sind, verwenden Sie die maximal mögliche g-Kraft und verlängern Sie die Zentrifugierdauer proportional. Zentrifugieren Sie so lange, bis die gesamte Flüssigkeit durch die Säule gelaufen ist.

Tabelle 2. Umwandlung der Zentrifugalkraft (in g-Einheiten) zu Umdrehungen pro Minute (RPM) für gängige Rotoren

Zentrifuge	Rotor	Röhrchen (max)	Radius (cm)	RPM bei 6,500 × g	RPM bei 12.000 × g	RPM bei 16.000 × g
Eppendorf 5410	-	12	5,8	10.012	13.555	15.652
5415C	F45-18-11	18	7,3	8.924	12.124	14.000
5415D&R	F45-24-11	24	8,3	8.369	11.392	13.155
5417C,D,&R	F45-30-11	30	9,5	7.823	10.634	12.279

Siehe die vorstehende Tabelle für Zentrifugiergeschwindigkeiten in RPM für ausgewählte gängige Zentrifugen und Rotoren. Die richtige RPM für nicht aufgelistete Rotoren kann mit folgender Formel berechnet werden:

wobei RCF = erforderliche Gravitationsbeschleunigung (relative Zentrifugalbeschleunigung, RZB) in g-Einheiten;
r = Radius des Rotors in cm;
RPM = Anzahl der erforderlichen Umdrehungen pro Minute, um die erforderliche g-Kraft zu erreichen.

Anhang 2   

Tabelle 3. Typische DNA-Ausbeute mit dem GenElute™-Kit für bakterielle genomische DNA

Quelle	Art von Medien	Menge von Übernachtkultur	OD600 je ml Übernachtkultur*	Typische DNA-Ausbeute (mit RNase-Behandlung)**
Escherichia coli, ATCC-Nr.: 11775	Terrific Broth (T9179)	0,8 ml	12,5	20 μg
Escherichia coli, ATCC-Nr.: 11775	Terrific Broth (L7658)	1,5 ml	5	20 μg
Escherichia coli DH10B	Terrific Broth (L7658)	1,0 ml	5	15 μg
Pseudomonas fluorescens, ATCC-Nr.: 13525	Terrific Broth (T9179)	0,8 ml	16	25 μg
Pseudomonas fluorescens, ATCC-Nr.: 13525	Terrific Broth (N7519)	1,5 ml	2	20 μg
Bacillus subtilis, ATCC-Nr.: 6051	Terrific Broth (T1438)	1,5 ml	6	25 μg
Streptococcus mutans, ATCC-Nr.: 35668	Terrific Broth (T1438)	1,5 ml	1,3	15 μg***
Streptococcus mutans, ATCC-Nr.: 14990	Terrific Broth (N7519)	1,5 ml	2	8 μg****
* Werte für Verdünnungsfaktor angepasst. Alle Messwerte wurden mit einem Varian-Cary® 100-Spektrophotometer erhalten. ** Basierend auf der Durchführung von Elutionen mit 200 µl. *** Die Lysozymlösung wurde mit 250 Einheiten/ml Mutanolysin (M9901) supplementiert. **** Die Lysozymlösung wurde mit 200 Einheiten/ml Lysostaphin (L7386) ergänzt.

Vorsichtsmaßnahmen und Haftungsausschluss

Das GenElute™-Kit für bakterielle genomische DNA ist nur für F&E-Zwecke vorgesehen, nicht für Arzneimittel, Haushalt oder andere Zwecke. Informationen zu Gefahren und zur sicheren Handhabung entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt (SDB).

GenElute ist eine Marke von Sigma-Aldrich Co. LLC.

Literatur

1. Sambrook, JF, Russell, D. ( 2001).. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY:

2. BIRREN B, LAI E. 1993. FIELD INVERSION GEL ELECTROPHORESIS.121-128. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-101290-8.50011-0