使用 Amicon^® Stirred Cell 進行濃縮和緩衝液交換簡介

• 產品
• 透過超濾加滲透同時進行樣品濃縮和緩衝液交換
• 連續與非連續 Diafiltration
• 連續性 Diafiltration 的緩衝需求

蛋白質、酵素、抗體和病毒等大分子溶液的樣品製備過程中，經常會在緩衝液中產生大量與下游製程或檢測不相容的稀釋大溶液。

離心式超濾裝置（例如 Amicon^® Ultra Filters）經常被用來濃縮和緩衝交換這些類型的大溶質；然而，大於 50 mL 的容量會帶來巨大的挑戰，需要將樣品分多階段裝載或在多個裝置上等分。

Amicon^® Stirred Cell 系列的壓力驅動過濾裝置提供了理想的解決方案，可用於濃縮和緩衝交換大量的大溶質。這些裝置有多種尺寸，可提供廣泛的處理量。若要處理更大的容量，可在任何 Amicon^® Stirred Cell 上安裝外部儲存器。 

新一代的Amicon^® Stirred Cells提供人體工學的優點、整合的安全功能、更安全的攪拌棒、優異的完整性和易用性，同時也提供更多的膜盤選擇。

請參閱 Amicon^® Stirred Cells 的改良設計如何實現更安全的組裝、更佳的元件完整性，以及同樣無與倫比的效能。

透過超濾加重析濾同時進行樣品濃縮與緩衝液交換

超濾是一種行之有效的樣品濃縮方法。當與重滲透結合時，所需的分析物質就能以相容於其他純化與分析步驟的濃度與緩衝液提供。在超濾過程中，由於非滲透物質的濃度增加，而流體體積減少，因此可達到所需的大溶質濃度。此外，膜滲透物質（如鹽和微溶質）的濃度保持不變。

如何針對樣本選擇正確的超濾膜 (NMWCO)

使用超濾進行樣本濃縮時，必須特別注意選擇正確的膜分子量截距以及膜材料。超濾膜通常由再生纖維素或聚醚砜 (PES) 製成。材料的選擇在很大程度上取決於樣品的相容性。膜標稱截留分子量 (NMWCO) 的選擇取決於要截留的大溶劑的分子量 (MW)。膜的選擇對性能有重大影響。一般來說，使用再生纖維素時，NMWCO 應該比要保留的溶質分子量小 2-3 倍，而使用 Biomax^® PES 膜時，NMWCO 應該比要保留的溶質分子量小 4-5 倍。

溶質截留可能會受到以下因素的進一步影響：

• 處理溫度
• 操作壓力
• 攪拌速度

您可能需要優化上述參數，以確保所需的產率。

Diafiltration 相比透析

Diafiltration 是一種使用超濾進行緩衝液交換的技術。滲透可以快速有效地消除大分子混合物中的鹽分和/或微溶質。

當使用重過濾以一種鹽類或微溶質取代另一種鹽類或微溶質時，則使用「洗去」一詞，就像在緩衝液交換過程中所做的一樣。

傳統透析是一種可替代的緩衝液交換技術；但是，它有幾個缺點：

1. 它依賴於緩慢的擴散和難以處理的透析管或透析盒。
   
2. 在很多情況下，透析過程中透析膜管中的容積會因滲透作用而增加，進一步稀釋樣品，並需要進行樣品濃縮步驟。
   
3. 透析可能需要大量緩衝液和多次更換緩衝液。

相反，重過濾使用超濾膜，在離心或壓力驅動的裝置（如 Amicon^® Stirred Cell）中進行高效緩衝液交換。 

使用攪拌池超濾進行重過濾的優點：

1. 與透析膜管不同，超濾膜既可以用於樣品濃縮，也可以用於緩衝液交換 
   
2. 最大限度地減少了樣品轉移，降低了樣品損失。
   
3. 與傳統透析相比，超濾所需的緩衝劑量通常要少得多。

Diafiltration	Dialysis
Transport convective with solvents, independent of microsolute composition	Transport diffusion-controlled, dependent on type of microsolute< /td>
Shaller volume required	High volume of exchange buffer volume required, efficient mixing and frequent buffers changes required driving efficient mixing and frequent buffers changes.
所需的交換緩衝劑體積較小	所需的交換緩衝劑體積較大，需要有效率的混合和頻繁的緩衝劑更換，以推動有效率的傳輸
快速交換速率。溶劑微溶劑的去除率與樣品成份無關	交換速度較慢，且效率會隨著微溶劑濃度降低而降低
交換速度較慢，且效率會隨著微溶劑濃度降低而降低	溫度降低時，超濾速率降低	溫度降低時，微溶劑傳輸降低
在高宏溶質含量時，超濾率和微溶質轉移會降低	微溶質轉移不受保留宏溶質含量的影響
可擴充；相容於幾微升到幾升的樣品	不易擴充到大容量，最好用於微升到升容量的樣品。

連續與非連續重過濾

重過濾可以連續或非連續模式進行。非連續重過濾指的是先濃縮樣本，然後用交換緩衝液稀釋到初始起始容量，接著再進行另一個濃縮步驟。

另一方面，連續重過濾可在整個緩衝液交換過程中維持固定的體積，方法是以去除濾液的相同速率引入交換緩衝液。

一般而言，連續重過濾比間歇重過濾更有效率。在非連續重過濾中，滲透通量會隨著樣品濃度的增加而降低，這可能會造成膜堵塞，並導致原本可以通過膜的微溶質截留增加。

計算連續重過濾的緩衝劑交換量

重過濾過程中的緩衝劑需求通常用 「重過濾量」（DV）來表示。DV 等於重過濾過程中去除的滲透物的體積除以剩餘的再滲透物的體積（等式 1）。

部分被膜截留的微溶劑需要額外的DV。作為一般的經驗法則，使用DV=3倍的樣品容量將洗掉95%，而使用DV=5倍的樣品容量將去除99%的非截留微溶劑。

等式2可用於重濾容量要求的理論計算。

等式 2 可用於理論計算重過濾容量需求，但這些只是指引，實際的重過濾容量需求需要根據經驗決定。

連續 Diafiltration 的緩衝器需求

更精確地描述洗入和洗出連續重過濾。該圖展示了通過膜（R=0）的微溶質以及部分截留的微溶質（R=0.1、0.2 等）的理論重疊過濾量。

計算非連續重疊過濾的緩衝液交換量

在非連續重疊過濾中，鹽分和微溶質的去除取決於重複濃縮/稀釋步驟中的濃縮程度。在每個步驟中，微溶劑含量會根據等式 3 減少。

範例：將 100 mL 含有 1 M 鹽的 1 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA) 蛋白質樣品濃縮至 50 mL，將蛋白質濃縮至 2 mg/mL，而鹽濃度保持在 1 M；然後，將樣品稀釋回 100 mL，將 BSA 濃度降至 1 mg/mL，鹽濃度降至 0.5 M。

重複這兩個步驟，直到鹽分降低到所需的濃度。

每個步驟之後的鹽分濃度可以使用公式 3 和公式 4 計算出來：

上述內容應被視為一項指引，因為樣品類型和成分差異很大，過度濃縮可能會造成有害後果。

雖然連續重過濾傳統上用於大容量切向流過濾 (TFF) 系統，但您也可以在 Amicon^® Stirred Cell 上使用這種溫和的緩衝液交換方式。

在樣品濃縮過程中用於擴大處理量的儲液器現在也可以用於重過濾緩衝液。一旦在整個設置中施加並均衡壓力，交換緩衝液將以去除滲透物的相同速率進入攪拌池。