一般注意事項
設定實驗室以避免污染
。聚合酶鏈式反應能夠擴增單一分子，這意味著微量的 DNA 雜質可以作為模板，導致擴增錯誤的模板 (假陽性)。請考慮下列各點，以避免來自下列來源的 PCR 污染：
- 實驗室工作台、設備和移液裝置，這些都可能被先前的 DNA 製備、質粒 DNA 或純化的限制性片段所污染。
- 樣本間的交叉污染。
- 先前 PCR 擴增的產物。
實驗室設施
- 至少使用實體分隔的工作場所：
- PCR前的模板準備
- 設置PCR反應
- PCR後的分析
- 使用不含DNase和RNase的薄壁PCR管。
- 使用特殊的抗霧化移液管吸頭和一套專用（僅用於 PCR）移液管，最好是正排量移液管。
- 如果可能，在配備紫外光的通風罩下進行 PCR 反應。
樣本處理
- 在 PCR 區域工作時，請使用無菌技術，並始終佩戴新手套。經常更換手套，尤其是當您懷疑手套已被含有模板 DNA 的溶液污染時。
- 總是使用新的和/或已消毒的玻璃器皿、塑料器皿和移液管來製備 PCR 試劑和模板 DNA。
- 對所有可高壓蒸汽消毒而不影響其性能的試劑和溶液進行自動高壓蒸汽消毒。當然，引物、dNTPs 和 Taq DNA Polymerase 不應該進行高壓消毒。準備一套僅用於 PCR 的 PCR 試劑和溶液。
- 移取 DNA 時，避免產生可能攜帶污染物的氣溶膠。
- 務必包含對照反應，例如陰性（"無 DNA"）對照（包含除模板 DNA 外的所有反應成分），以及在之前的 PCR 中成功使用過的陽性對照。
特殊設備
Type of Thermal Cycler
熱循環器至少必須準確且可重複地維持三種 PCR 溫育溫度 (請參閱
)a href="#Thermal-cycling-profile-for-standard-PCR">Thermal Cycling Profile for Standard PCR），在可確定的時間內從一個溫度轉換到另一個溫度（斜坡"ramp"），在達到所選溫度時沒有明顯的過高或過低，並在溫度之間重複且可重複地循環。注意：
反應管的類型
反應管會影響熱量從熱循環器傳遞到反應混合物的速率。因此，最好使用專門為 PCR 設計的薄壁反應管，並且能夠精確地插入您所使用的特定品牌熱循環器的孔中。
PCR Reaction Components
Template
模板的品質會影響 PCR 的結果。例如，DNA 模板中的大量 RNA 會螯合 Mg2+ ，降低 PCR 的產率。此外，不純的模板可能含有聚合酶抑制劑，降低反應的效率。
注意： 要獲得最純的模板，請務必使用專門用於純化 DNA 的純化產品，例如 High Pure PCR Template Preparation Kit.
模板的完整性也很重要。模板 DNA 應該是高分子量的。要檢查 DNA 的大小和品質，可將等分的 DNA 在瓊脂糖凝膠上檢測。測試新模板時，一定要使用能擴增已知大小且產率高的產物的引物進行陽性對照。
反應中的模板量會強烈影響 PCR 的性能。標準 PCR 的建議模板量為：
- 最多 500 ng 人類基因組 DNA
- 1 - 10 ng 細菌 DNA
- 0.1 - 1 ng 質粒 DNA
低量的模板，例如，<10 ng 人類基因組 DNA，將需要特定的反應修改，例如改變週期數、重新設計引物、使用熱啟動等。
引物
在大多數 PCR 應用中，引物的順序和濃度決定了整體檢測的成功與否。為了方便起見，有幾種引物設計軟體程式可供使用。這些軟體可用來確保引物序列具有下列一般特性：
- 18-24個碱基長
- 無內部次級結構
- 40 - 60% G/C
- G/C和富含A/T的區域均衡分佈。
- 3´端不互補（引物二聚體不會形成）。
- 熔融溫度 (Tm)，允許退火溫度為 +55 至 +65 °C（為達到最大特異性，使用 +62 至 +65 °C）。
注意：最佳退火溫度通常高於引物的 Tm（約 +5 至 +10 °C），因此必須根據經驗決定。
可以在引物的 5´ 端添加不與模板雜交的碱基（例如， 將限制位點引入擴增產物）。引物濃度在 0.1 到 0.6 µM 之間通常是最佳的。較高的引物濃度可能會導致引物錯誤引導和非特異產物的累積。
注意： 對於某些系統，較高的引物濃度（高達 1 µM）可能會改善結果。測試新引物時，務必使用已在 PCR 中測試過功能的模板進行陽性對照反應。此對照可顯示引物是否有效。
DNA聚合酶的選擇
DNA聚合酶的選擇會深刻地影響PCR的結果。對於大多數常規 PCR，Taq DNA 聚合酶一直是標準的 PCR 酵素。然而，Taq DNA 聚合酶也有其局限性。對於大多數測試，最佳的恒溫 DNA 聚合酶（或混合聚合酶）用量為 0.5 到 2.5 個單位/50 µL 反應容量。增加酵素濃度有時會導致特異性降低。
MgCl2 Concentration
Mg2+ forms soluble complexes with dNTPs to produce the actual substrate that the polymerase recognizes.游離 Mg2+ 的濃度取決於結合該離子的化合物濃度，包括 dNTP、游離焦磷酸 (PPi) 和 EDTA。為了獲得最佳結果，請務必根據經驗確定最佳 Mg2+ 濃度。最佳 Mg2+ 濃度大約在 1 - 5 mM 之間。最常用的 Mg2+ 濃度為 1.5 mM（dNTPs 的濃度各為 200 µM）。Mg2+ 會影響酵素的活性，並增加雙鏈 DNA 的 Tm。反應中過多的 Mg2+ 會增加非特異引物結合，並增加反應的非特異背景。
三磷酸去氧核苷酸 (dNTP) 的濃度
請務必使用所有四種 dNTP 的平衡溶液，以盡量減少聚合酶的錯誤率。不平衡的 dNTP 混合物會降低 Taq DNA 聚合酶的保真度。
注意： 為了最大程度的方便，可將預混合、平衡的 dNTPs 混合物（如 PCR Nucleotide Mix ）作為單一試劑加入反應混合物中。此外，PCR 級 dATP, dGTP, dCTP、 脫氧核苷三磷酸鹽組合，PCR等級可供使用。
如果您增加 dNTPs 的濃度，您也必須增加 Mg2+ 濃度。dNTP 濃度的增加會減少游離 Mg2+，因此會干擾聚合酶的活性並降低引物退火的速度。為了防止攜帶污染，通常使用較高濃度的 dTTP（詳情請參閱 Preventing carryover contamination with uracil-DNA glycosylase）。最終的 dNTP 濃度應為 50 - 500 µM（每種 dNTP）。最常用的 dNTP 濃度為 200 µM。
pH
一般而言，相應的恒溫 DNA 聚合酶所提供的反應緩衝液的 pH 值（pH 8.3 - 9.0）會得到最佳結果。
反應添加劑
在某些情況下，加入下列化合物可以提高 PCR 的效率或特異性：
- 甜菜鹼（0.5 - 2 M）
- 牛血清白蛋白（BSA；100 ng/50 µL）
- 去垢劑
- 二甲基亞砜（DMSO；2 - 10%) (v/v)
- 明胶
- 甘油 (1 - 5%) (v/v)
- 焦磷酸酶 (0.001 - 0.1 units/reaction)
- Spermidine
- T4 Gene 32 protein
- Formamide
Thermal Cycling profile for Standard PCR
初始變性
模板 DNA 必須完全變性。將 PCR 混合物在 +94 至 +95 °C 下初步加熱 2 分鐘，就足以使複雜的基因組 DNA 完全變性，以便引物在反應混合物冷卻時可以退火到模板上。如果模板 DNA 僅部分變性，則會很快縮回，妨礙引物的有效退火和延伸，或導致引物自吸，造成假陽性結果。
循環過程中的變性步驟
在 +94 至 +95 °C 下變性 20 - 30 秒通常就足夠了，但必須根據使用的熱循環器和試管進行調整。例如，在 500 µL 试管中变性所需的时间比在 200 µL 试管中变性所需的时间长。如果變性溫度太低，未完全融化的 DNA 就會如前所述發生 「回彈」，無法接觸到引物。對於富含 GC 的模板 DNA，請使用較長的變性時間或較高的變性溫度。
注意：切勿使用長於模板 DNA 完全變性所需的變性時間。
引物退火
對於大多數目的，退火溫度必須根據經驗進行優化。引物退火溫度的選擇可能是設計高特異性 PCR 的最關鍵因素。如果溫度太高，就不會發生退火，但如果太低，非特異性退火就會大幅增加。
引物延伸
對於 3 kb 以下的片段，引物延伸通常在 +72 °C 下進行。Taq DNA Polymerase 在 +72 °C 下每秒可增加約 60 個碱基。對於 1 kb 以下的片段，45 秒的延伸就足夠了。對於延伸至 3 kb 的片段，每 kb 約需 45 秒。然而，這些時間可能需要針對特定的模板進行調整。為了提高產量，請使用熱循環儀的循環延伸功能。例如，以固定的延伸時間（例如，1 kb 產品為 45 秒）執行前 10 個循環。然後，在接下來的 20 個循環中，每個循環的延伸時間增加 2-5 秒 (例如. 循環 11 為 50 秒，循環 12 為 55 秒，等等)。循環延展可讓酵素有更多時間完成工作，因為隨著 PCR 的進行，有更多的模板需要擴增，而進行延展的酵素（因為在長時間的高 PCR 溫度下會變性）則較少。
週期數
在最佳反應中，少於 10 個模板分子可以在少於 40 個週期內擴增，得到容易在溴化乙锭染色的凝膠上檢測到的產物。因此，大多數 PCR 應該只包含 25 到 35 個週期。隨著週期數的增加，非特異性的產物會累積（圖 1）。
圖 1.過度循環對不純模板和純模板的影響。在一系列反應中重新擴增 PCR 产物（多巴胺 2 受體基因第 6 外顯子的 245 bp 擴增子）。在其中一組實驗中，模板在使用前沒有純化。在第二組實驗中，模板在重新擴增之前經由瓊脂糖凝膠電泳純化。在這兩組實驗中，模板都經過 40、60 或 72 個循環的擴增。在 3% 琼脂糖凝胶上分析等量（8 µL）的产物。
| Length | 可擴增序列的長度。 |
| Specificity | 非特異性擴增的程度，特別是當需要擴增困難的範本時。 |
| 可重複性 | 使用不同批次酵素所得結果的一致性。 |
| 靈敏度 | 擴增效率取決於模板的數量。 |
| Robustness | 酵素系統易受污染因子或其他降低擴增效率的因素（如強次級結構）影響的程度。 |
| 精確度 | 與 Taq DNA Polymerase 相比，酵素系統的錯誤率是以錯誤併入核苷酸的相對數量來定義的。 |
| Carryover Prevention | 定義一個酵素系統是否可以使用 dUTP 來取代 dTTP，以使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UNG) 來應用 PCR carryover prevention 的程序。 |
RT-PCR中需要考慮的因素
RT-PCR 酶的選擇
顯然，在 RT-PCR 中，需要考慮的一個主要因素是用來合成 cDNA 的逆轉錄酶的選擇。由於每種可用的酵素都有不同的酵素特性，其中一種酵素可能比其他酵素更適合特定的實驗。
最佳溫度
較高的孵育溫度有助於消除模板次級結構的問題。此外，高溫可減少假引物，從而改善逆轉錄的特異性。因此，可在高溫（+50 至 70 °C）下培養的熱活性逆轉錄酶更有可能產生精確的 mRNA 副本，尤其是當模板具有高 GC 含量時。
注意：在這些高溫下，只能使用特定的引物；不要使用 oligo(dT) 或隨機六聚體引物。
二價離子需求
大多數逆轉錄酶的活性需要二價離子。使用 Mg2+ 的酵素可能比使用 Mn2+的酵素產生更精確的 cDNA 副本，因為 Mn2+ 會對 DNA 合成的保真度造成負面影響。
特異性和敏感性
逆轉錄酶複製少量模板的能力（敏感性）各不相同。
酵素概況
表 2 顯示 Roche 提供的 RT-PCR 酵素和試劑盒的應用概況。
表 2.Roche 提供的 RT-PCR 酵素和試劑盒的應用概況。
反轉錄引物的選擇
引物會影響所產生 cDNA 的大小和特異性。有三種引物可用於反轉錄：
- Oligo(dT)12-18，它與哺乳類動物 mRNA 3´ 端的內源 poly(A)+ 尾部結合。這種引物通常會產生全長的 cDNA。
- 隨機六核苷酸，會在各種互補位點上與 mRNA 結合，並產生部分長度（短）的 cDNA。隨機六核苷酸可能是克服模板中廣泛次級結構所帶來的困難的理想選擇。這些引物也可以更有效地轉錄 mRNA 的 5´ 區域。
- 特異性寡核苷酸引物，可選擇性地引導感興趣的 mRNA。
Preparation of template RNA
成功的 RT-PCR 需要高品質、完整的 RNA 模板。使用以下指南來幫助製備此模板：
- 為了最小化細胞裂解過程中釋放出來的 RNase 的活性，在裂解混合物中加入 Protector RNase Inhibitor 或使用同時破壞細胞和使 RNase 失活的方法。
- 採取步驟消除玻璃器皿、塑膠器皿、試劑等所有可能的 RNase 污染源。
- 使用專門為核酸純化設計的產品製備起始模板 RNA，例如羅氏提供的 RNA 製備產品。
- 使用純化的 mRNA 作為模板，而不是總 RNA。從 poly(A)+ mRNA 開始將大大增加成功擴增稀有 mRNA 的可能性，因為 mRNA 在總 RNA 製備中所佔的比例相當低（通常為哺乳動物細胞總 RNA 的 1 - 5%）。
- 如果使用 mRNA 作為模板，在 RT-PCR 中使用之前，先用凝膠電泳檢查 mRNA 的完整性。mRNA 應該呈現在大約 500 bp 到 8 kb 之間的塗片。大部分的 mRNA 應介於 1.5 kb 和 2 kb 之間。
引物設計
RT-PCR 擴增特定的 mRNA 序列需要兩個對該 mRNA 序列具有特異性的 PCR 引物。引物設計還應該能夠區分 cDNA 的擴增产物和來自污染基因組 DNA 的擴增产物。設計所需引物有兩種方法（圖 2）。
圖 2.引物設計方法。
面板 1：製作與內含子兩側外顯子序列退火的引物。使用這些引物，從基因組 DNA 擴增的任何結果都會比從無內含子 mRNA 擴增的結果大得多。
面板 2：製作跨越 mRNA 上外顯子/外顯子邊界的引物。
RT-PCR 程序
RT-PCR 可以以兩步法或一步法的方式進行。每種方法都有一定的優點。
1. 兩步程序
A.雙管兩步程序
在第一管中，第一鏈 cDNA 合成在最佳條件下進行，使用隨機六聚體、oligo(dT) 引物（產生 cDNA 池）或序列特異性引物。然後將 RT 反應的等分部分轉移到另一個試管（內含恒溫 DNA 聚合酶、DNA 聚合酶緩衝液和 PCR 引物）中進行 PCR。
這種方法的優點：這種方法適用於必須從同一個 RT 反應分析多個轉錄本的實驗，或是特定的應用，例如差異顯示反轉錄 (DDRT) 或 cDNA 末端快速擴增 (RACE)。此外，由於 RT 反應是在最佳條件下進行，這種方法可產生最長的 RT-PCR 產物（若使用適當的酵素，長度可達 14 kb）。
B.一管兩步法
在第一步中，逆轉錄酶在 Mg2+ 離子、高濃度 dNTPs 和特異性或非特異性 [oligo(dT)] 引物（反應量，20 µL）的存在下產生第一鏈 cDNA。RT 反應之後，將最佳化的 PCR 緩衝液 (不含 Mg2+ 離子)、恒溫 DNA 聚合酶和特異性引物加入管中，並進行 PCR。
兩步程序具有以下優點：
- 優化反應條件。 两步法允许在最佳条件下进行反转录和 PCR，以确保高效、准确的扩增。
- 提供灵活性。 两步法程序允许将单个 cDNA 合成反应的产物用于分析多个转录本。這種靈活性對於快速擴增 cDNA 末端 (RACE) 和差示反轉錄 (DDRT) 等專門應用非常有價值。
- 擴增長序列。使用正確的反轉錄酶和耐熱 DNA 聚合酶組合，兩步式 RT-PCR 可以擴增長達 14 kb 的 RNA 序列。
2.一管一步法（耦合 RT-PCR）
cDNA 合成和 PCR 擴增都使用相同的緩衝液和位點特異性引物，無需在 RT 和 PCR 步驟之間打開反應管。此方法除了靈敏度較高外（如同上述的一管兩步反應），一步法還可將污染機會降到最低，因為整個反應只需最少的移液步驟即可完成，無須開啟反應管。此外，由於兩個步驟中使用的引物都是序列特異的，因此這種方法允許直接分析特定的轉錄本。
一步法具有以下優點：
- 縮短所需時間。 一步式反應的移液步驟比兩步式反應少，可大幅減少進行 RT-PCR 所需的時間，並避免移液錯誤。
- 降低污染風險。 整個一步反應在單管中進行，不需要轉移，也不需要打開反應管（可能發生 PCR 樣品污染的步驟）。
- 提高了 cDNA 合成的靈敏度和特異性。 一步反應的兩個特點提高了產量和效率：(1) cDNA 反應在高溫下進行（消除了 RNA 次級結構的問題）；(2) 整個 cDNA 樣品都用作 PCR 的模板。
Preventing Carryover Contamination with Uracil-DNA Glycosylase
聚合酶鏈式反應 (PCR) 可以將單一分子放大十億倍以上。因此，即使是微量的污染物也可能被擴增，並導致假陽性結果。這些污染物通常是先前 PCR 擴增的產物（攜帶污染）。
一種常見的策略是在 PCR 擴增過程中用 dUTP 取代 dTTP，以產生含尿嘧啶的 DNA (U-DNA)。在 PCR 擴增之前，先用尿嘧啶-DNA 糖基化酶 (UNG) 處理後續的 PCR 反應混合物，然後在鹼性條件下於高溫 (+95 °C)（初始變性步驟期間）裂解嘧啶多核苷酸，就能去除樣品中的污染性 U-DNA（圖 3）。當然，這種方法要求實驗室中所有的 PCR 反應都使用 dUTP 而不是 dTTP。
圖 3.用尿嘧啶-DNA 糖基化酶去除污染的 U-DNA。
在下游應用中使用含 dU 的 PCR 產物時，請注意以下幾點：
- 含 dU 的 PCR 產物在用作雜交靶點或雙脫氧測序模板時，與含 dT 的 PCR 產物性能相同。
- 如果將含 dU 的 PCR 產物轉換到非細菌宿主中，它們可以被直接克隆。
- 含 dU 的底物很容易被一些常見的限制性酵素消化（e.g.、Eco RI 和 Bam HI）消化，而另一些限制酶（e.g、Hpa I、Hind II、Hind III）在这些底物上的活性降低。
- 我們不建議使用含 dU 的 DNA 進行蛋白質結合或 DNA 蛋白質互作研究。
防止 RT-PCR 中的攜帶污染
在擴增 RNA 時，有兩種防止攜帶污染的方法：
- 使用單管、單步 RT-PCR 程序，以減少處理和移液步驟以及打開反應管的次數。
- 在有 dUTP 存在的情況下進行一步式 RT-PCR，這樣所有的產物都會含有 dU，可以用 UNG 從後續的 PCR 中去除（參見 用 Uracil-DNA Glycosylase 防止攜帶污染）。這可以防止後續 PCR 中的攜帶污染。
疑難排解
以下是我們根據觀察到的五種最常見症狀所收集到的一些有關 PCR 的疑難排解提示。在您開始之前，請確認您已檢閱其他應用程式提示。
No Product
如果您的 PCR 沒有得到產品，以下是我們收集的一些故障排除提示。
1.非最佳 Mg2+ 濃度
建議： 使用我們的PCR 優化套件滴定鎂濃度。
2.反應中模板的量不是最佳
模板的必要量因反應而異。作為指引，每 100 µL 反應使用 100 - 750 ng 人類 DNA（105 - 106 拷貝）。
建議：
- 試測反應中的模板量。
- 進行優化實驗，在建議的範圍內以 0.50 的增量改變酶濃度（0.5 to 5.0 units).
3.反应中存在酶抑制剂
已知的 PCR 抑制剂包括：
- 50 mM 氯化铵
- EDTA （金属螯合剂）
- >0.8 µM hematin
- PBS (磷酸會結合游離鎂)
- >0.02 % sarcosyl
- 0.5 M 尿素
- >5% DMF
- >10% 甲酰胺
- 肝素
- >20% PEG 脱氧胆酸酯
- >0.01% SDS (可用等摩爾比的 NP40 和 Tween 20 反轉)
- >10% DMSO
- >20% 甘油
- >0.4% N-辛基葡萄糖苷
- 殘餘酚
- >0。06% 脱氧膽酸钠
- 焦磷酸
建議： 降低或去除反應混合物中任何抑制劑的濃度。
4.引物退火溫度過高或過低
引物退火溫度通常為 +50 至 +60 °C（根據引物序列和緩衝成分，可能會更高或更低）。
建議： 根據以下公式確定 Tm/退火溫度：
如果引物是 20-35 個碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G 或 C) + (# A 或 T)
Tp = 有效退火温度 ± 2 - 5
如果引物是 14 - 70 个碱基
Tm = 81.5 + 16.6 (log10 [J+]) + 0.41 (% G + C) - (600/l) - 0.063 (% Formamide) + 3 to 12
[J+] = 一價陽離子的濃度
l = 寡聚物的長度
5.引物已降解或不是最佳引物
引物的 A 和 T 的數目應與 G 和 C 的數目相同，而且引物應至少有 14 個碱基，以達到特異性。
建議：
- 如果引物很短且富含 A-T，則加入 0.9 - 2.0% (v/v) DMSO。
- 如果引物富含 G-C，添加 1 - 10% (v/v) 甲酰胺。
- 雙重檢查引物序列，如果有的話，使用引物設計程序。
- 在凝膠上檢查引物的等分量，確保引物沒有降解。模板變性不完全
變性步驟中加熱不足是 PCR 反應失敗的常見原因。使反應達到能完全分離鏈的溫度是非常重要的。在大多數情況下，約 +94 ℃ 的溫度持續 2 minutes 應該就足夠了。
當樣本達到 +94 ℃ 時，就可以冷卻到退火溫度。
DNA反應緩衝液中的鎂濃度較高（4 - 5 mM），可能需要較高的變性溫度，才能使DNA模板鏈完全分離。
建議：
- 提高初始變性溫度至 +95 至 +97 °C。
- DNA減酶和緩衝液變性 4 - 6 分鐘。
- 增加循環變性時間 15 - 30 秒。
- 嘗試熱啟動技術。
- 閉合迴圈 DNA 應在 PCR 前切割，未切割的迴圈變性太快。
7.基於機器的錯誤
建議：
- 校準加熱塊並確認實際的加熱塊溫度。
- 針對特定機器執行診斷程式 - 請聯絡機器製造商以瞭解具體情況。
8.由於模板的次級結構、回扣或引物 3´ 端過多的同源性而導致的錯誤引物
建議：
- 提高初始變性溫度至 +95 至 +97 °C。
- 將 DNA 減去酵素和緩衝液變性 4 - 6 分鐘。
- 增加循環變性時間 15 - 30 秒。
- 嘗試熱啟動技術。
- 加入 T4 基因 32 蛋白 3 - 5 µL / mL。
- 設計引物時，確保 3 ´末端的同源性不超過 2 個碱基。如果有引物設計程式，請使用。
- 考慮在反應緩衝液中加入共溶劑：
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% 甲酰胺
- 5 - 15% 聚乙二醇
- 10 - 15% 甘油
9.NaCl 濃度超過 50 mM
建議： 降低 NaCl 濃度
10.KCl 濃度高於 50 mM
Misincorporation or Low Fidelity
以下是我們收集到的一些有關 PCR 反應中誤鍵入或低保真度的疑難排解提示。
1.非最佳 Mg2+ 濃度
建議： 使用我們的 PCR Optimization Kit 滴定鎂濃度。
2.核苷酸濃度過高或不平衡
每種核苷酸的標準濃度為 20 - 200 µM。
建議：
- 檢查所有核苷酸的儲備溶液濃度。
- 再次檢查所有核苷酸的最終濃度。
3.反應緩衝液的 pH 值過高
最佳 pH 值為 8.3。
建議：
- 反應緩衝液的 pH 可降至 5 - 6。
- pH值降低3個單位時，鹽基取代的變化減少60倍，框架移位的變化減少11倍。由於模板的次級結構、回扣或引物 3´ 端過多的同源性而導致的錯誤引物
建議：
- 增加初始變性溫度至 +95 至 +97 °C。
- 將 DNA 減去酵素和緩衝液變性 4 - 6 分鐘。
- 增加循環變性時間 15 - 30 秒。
- 嘗試熱啟動技術。
- 加入 T4 基因 32 蛋白 3 - 5 µL / mL。
- 設計引物時，確保 3 ´末端的同源性不超過 2 個碱基。如果有引物設計程式，請使用。
- 考慮在反應緩衝液中加入共溶劑：
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% 甲酰胺
- 5 - 15% 聚乙二醇
- 10 - 15% 甘油
5.模板 DNA 受損
建議：
- 盡量減少循環次數，因為在高 pH 值下重複加熱/冷卻會損壞模板（大多數模板需要 25 - 35 個循環）。
- 減少循環變性時間至 15 - 30 秒
非特異性帶
以下是我們收集到的一些關於 PCR 反應後非特異性帶的疑難排解提示。
1.非最佳 Mg2+ 濃度
建議： 使用我們的 PCR 優化套件滴定鎂濃度。核苷酸濃度過高或不平衡
每種核苷酸的標準濃度為 20 - 200 µM。
建議：
- 檢查所有核苷酸的庫存溶液濃度。
- 雙重檢查所有核苷酸的最終濃度。
3.DNA 污染/攜帶
建議：
- 在不加入目標 DNA 的情況下進行 PCR 測試是否有攜帶。
要防止攜帶，請使用良好的實驗室實踐：
- 物理隔離 PCR 預製品和產品
- 溶液、吸頭和試管經過空氣消毒
- 使用正向置換移液管消除氣溶膠
- 預混合試劑
- 小心選擇陽性和陰性對照
- 將膠盒和梳子浸泡在1 M HCl中使DNA脫毛
- 用新鮮保鮮膜覆蓋 UV 盒
- 經常使用油覆蓋
消除污染/攜帶：
- UV照射：混合除模板 DNA 以外的所有成分；在透明的 0.5 mL 聚丙烯管中直接與玻璃透射光儀（254 和 300 nm 紫外燈泡）接觸，照射 5 分鐘：
- UNG消化：將dUTP核苷酸導入反應中，並進行隨後的尿嘧啶DNA糖基化酶消化。
4.引物退火溫度太低
引物退火溫度通常為+50至+60 °C（根據引物序列和緩衝液成分，可能會更高或更低）。
建議： 根據以下公式確定 Tm/退火溫度：
如果引物是 20-35 個碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G 或 C) + (# A 或 T)
Tp = 有效退火温度 ± 2 - 5如果引物是 14 - 70 个碱基
Tm = 81.5 + 16.6 (log10 [J+]) + 0.41 (% G + C) - (600/l) - 0.063 (% Formamide) + 3 to 12
[J+] = 一價陽離子的濃度
l = 寡聚物的長度5.由於模板的次級結構、卡回或引物 3´ 端過多的同源性而導致的錯誤引物
建議：
- 增加初始變性溫度至 +95 至 +97 °C。
- 將 DNA 減去酵素和緩衝液變性 4 - 6 分鐘。
- 增加循環變性時間 15 - 30 秒。
- 嘗試熱啟動技術。
- 加入 T4 基因 32 蛋白 3 - 5 µL / mL。
- 設計引物時，確保 3 ´末端的同源性不超過 2 個碱基。如果有引物設計程式，請使用。
- 考慮在反應緩衝液中加入共溶劑：
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% 甲酰胺
- 5 - 15% 聚乙二醇
- 10 - 15% 甘油
6.引物已降解或不是最佳引物
引物應該有相同數量的 A 和 T 與 G 和 C，而且它們應該至少有 14 個碱基以達到特異性。
建議：
- 如果引物很短且富含 A-T，則加入 0.9 - 2.0% (v/v) DMSO。
- 如果引物富含 G-C，添加 1 - 10% (v/v) 甲酰胺。
- 雙重檢查引物序列，如果有的話，使用引物設計程序。
- 在凝膠上檢查等分的引物，確保它們沒有降解。引物濃度太高
建議： 調整引物濃度（每種引物的濃度在 0.1 - 1.0 µM 最為理想）。循環數太高
大多數模板需要 25 - 30 個循環。
建議： 循環數應基於模板 DNA 的起始濃度。
如果您樣本中的目標分子數量是... 那麼我們建議以下循環數... 3 x 105 25 - 30 1.5 x 104 30 - 35 1.0 x 103 35 - 40 40 - 45 9.模板與酵素的比例不正確
模板的必要量因反應而異。作為指引，每 100 µL 反應使用 100 - 750 ng 人類 DNA（105 - 106 copies）。
建議：
- 試測反應中的模板量。
- 進行優化實驗，在建議的範圍（0.5 至 5.0 單位）內以 0.50 的增量改變酶濃度。
Smeared Bands
以下是我們收集到的一些有關 PCR 反應後染色帶的疑難排解提示。
1.非最佳 Mg2+ 濃度
建議： 使用我們的 PCR 優化套件滴定鎂濃度。核苷酸濃度過高或不平衡
每種核苷酸的標準濃度為 20 - 200 µM。
建議：
- 檢查所有核苷酸的儲備溶液濃度。
- 雙重檢查所有核苷酸的最終濃度。
3.DNA 污染/攜帶
建議：
- 在不加入目標 DNA 的情況下進行 PCR 測試是否有攜帶。
要防止攜帶，請使用良好的實驗室實踐：
- 物理隔離 PCR 預製品和產品
- 溶液、吸頭和試管經過空氣消毒
- 使用正向置換移液管消除氣溶膠
- 預混合試劑
- 小心選擇陽性和陰性對照
- 將膠盒和梳子浸泡在1 M HCl中使DNA脫毛
- 用新鮮保鮮膜覆蓋 UV 盒
- 經常使用油覆蓋
消除污染/攜帶：
- UV照射：混合除模板 DNA 以外的所有成分；在透明的 0.5 mL 聚丙烯管中直接與玻璃透射光儀（254 和 300 nm 紫外燈泡）接觸照射 5 分鐘：
- UNG消化：將dUTP核苷酸導入反應中，並進行隨後的尿嘧啶DNA糖基化酶消化。
4.引物退火溫度太低
引物退火溫度通常為+50至+60 °C（根據引物序列和緩衝液成分，可能會更高或更低）。
建議： 根據以下公式確定 Tm/退火溫度：
如果引物是 20-35 個碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G 或 C) + (# A 或 T)
Tp = 有效退火温度 ± 2 - 5如果引物是 14 - 70 个碱基
Tm = 81.5 + 16.6 (log10 [J+]) + 0.41 (% G + C) - (600/l) - 0.063 (% Formamide) + 3 to 12
[J+] = 一價陽離子的濃度
l = 寡聚物的長度5.由於模板的次級結構、卡回或引物 3´ 端過多的同源性而導致的錯誤引物
建議：
- 增加初始變性溫度至 +95 至 +97 °C。
- 將 DNA 減去酵素和緩衝液變性 4 - 6 分鐘。
- 增加循環變性時間 15 - 30 秒。
- 嘗試熱啟動技術。
- 加入 T4 基因 32 蛋白 3 - 5 µL / mL。
- 設計引物時，確保在 3´ 端有不超過 2 個同源碱基。如果有引物設計程式，請使用。
- 考慮在反應緩衝液中加入共溶劑：
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% 甲酰胺
- 5 - 15% 聚乙二醇
- 10 - 15% 甘油
6.DNase 活性（在凝膠上顯示的污點低於預期帶大小）
建議：
- 製作新鮮的儲備溶液。
- 檢查模板 DNA 的完整性。
7.凝膠樣品的油污染
引物退火溫度通常為 +50 至 +60 °C（根據引物序列和緩衝液成分，可能會更高或更低）。
建議：旋轉反應管，小心抽取表面的油層。
8.模板與酶的比例不正確
模板的必要用量因反應而異。作為指引，每 100 µL 反應使用 100 - 750 ng 人類 DNA（105 - 106 copies）。
建議：
- 試測反應中的模板量。
- 進行優化實驗，在建議的範圍（0.5 至 5.0 單位）內以 0.50 的增量改變酶濃度。
低收率
以下是我們收集到的一些有關 PCR 反應後低收率的疑難排解提示。
1.引物退火溫度過高
引物退火溫度通常為 +50 至 +60 °C（根據引物序列和緩衝液成分，可能會更高或更低）。
建議： 根據以下公式確定 Tm/退火溫度：
如果引物是 20-35 個碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G 或 C) + (# A 或 T)
Tp = 有效退火温度 ± 2 - 5如果引物是 14 - 70 个碱基
Tm = 81.5 + 16.6 (log10 [J+]) + 0.41 (% G + C) - (600/l) - 0.063 (% Formamide) + 3 to 12
[J+] = 單價陽離子的濃度
l = 寡聚物的長度2.模板未清潔或已降解
例如，蛋白酶污染會使聚合酶降解。
建議：
- 嘗試熱啟動技術。
- 盡可能純化 DNA 模板，包括蛋白酶 K 消化。反應中有酶抑制劑
已知的 PCR 抑制劑包括：
- 50 mM 氯化銨
- EDTA (金屬螯合劑)
- >0.8 µM hematin
- PBS (磷酸會結合游離鎂)
- >0.02 % sarcosyl
- 0.5 M 尿素
- >5% DMF
- >10% 甲酰胺
- 肝素
- >20% PEG 脱氧胆酸酯
- >0.01% SDS (可用等摩爾比的 NP40 和 Tween 20 反轉)
- >10% DMSO
- >20% 甘油
- >0.4% N-辛基葡萄糖苷
- 殘留苯酚
- >0.06% 脱氧膽酸钠
- 焦磷酸
建議： 降低或去除反應混合物中任何抑制劑的濃度。
4.反應中的模板不足
模板的必要量因反應而異。作為指引，每 100 µL 反應使用 100 - 750 ng 人類 DNA（105 - 106 copies）。每個模板的酵素用量都應該最佳化。
建議：
- 試測反應中模板的用量。
- 在建議的範圍（0.5 至 5.0 單位）內，以 0.50 的增量改變酵素濃度，進行最佳化實驗。
5.延展溫度太高
最佳延展溫度和時間取決於片段大小：
- +72 °C 20 秒，對於片段 <500 bp.
- +72 °C 40 秒，對於片段 1.2 bp.
建議： 當模板較長或存在可疑的次級結構時，應使用較長的時間，而不是較高的溫度。
6.酶活性低
對於羅氏聚合酶，100%的活性保證到控制日期。
建議：
- 檢查控制日期。
- 嘗試熱啟動技術，以幫助在熱循環中保持活性。
Suggestion: Cycle number should be based on starting concentration of template DNA.
如果您樣本中的目標分子數量是... 那麼我們建議以下循環數... 3 x 105 25 - 30 1.5 x 104 30 - 35 1.0 x 103 35 - 40 40 - 45 8.核苷酸水解
核苷酸儲備溶液的儲存濃度至少要有 10 mM，最好是 100 mM。在 1 mM 儲存 2 個月後會發生顯著的水解。
將 NTP 或 dNTPs 溶解在預期濃度為 10 mM 的水中。使用 0.05 M Tris-base 和 pH 試紙，將 pH 調至 7.0。適當稀釋等分的中和 NTP 或 dNTP，並在下表所給的波長下讀取光密度。使用消光係數的值計算實際濃度。以小份等分的方式在 -20 °C 下凍結。
基底 波長 基的消光係數 e (M-1 cm-1) A 259 1.54 x 104 T 260 7.4 x 103 G 253 1.37 x 104 C 271 9.1 x 103 U 262 1.0 x 104 鋰鹽和鈉鹽具有同等的穩定性，在 PCR、測序和標記應用中效果相同。鋰鹽比鈉鹽更容易溶於乙醇。因此，以乙醇沉澱去除鋰鹽比去除鈉鹽更有效率。使用鋰鹽核苷酸製劑可減少鹽引起的假象，並增加測序凝膠的可讀性。
9.核苷酸濃度過高或不平衡
標準濃度為每個核苷酸 20 - 200 µM。
建議：
- 檢查所有核苷酸的儲備溶液濃度。
- 雙重檢查所有核苷酸的最終濃度。引物濃度太低
建議：調整引物濃度 (0.1 - 1.0 µM 的每個引物是最佳的).
11.基於機器的錯誤
建議：
- 校準加熱塊並確認實際的加熱塊溫度。
- 針對特定機器執行診斷程式 - 與機器製造商聯繫以獲得具體資訊。高原效應
造成高原效應的可能原因/解決方案：
- dNTP的使用量 - dNTP濃度應為每個20 - 200 µM。
- 終產物焦磷酸抑制 - 減少循環數至20 - 35，以減少焦磷酸的形成。
- 高濃度時產物變性不完全 - 使用逐步循環，增加後續循環的變性時間。
- 底物/酵素比例中底物過量 - 使用逐步循環，增加後續循環的延伸時間或酵素濃度。蒸發
蒸發會導致成分濃度升高，可能抑制酵素活性。體積的變化也會導致反應管內熱圖的變化。
建議：使用 100 µL 礦物油覆蓋/反應。
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