使用 StrepTrap™ HP 1 mL 和 5 mL 進行純化

StrepTrap™ HP 1 mL 和 5 mL 色譜柱由生物相容性良好的聚丙烯製成，不會與生物大分子產生交互作用（圖 7.2）。預包裝 StrepTrap™ HP 色譜柱以方便的形式提供快速、簡單和容易的分離。

StrepTrap™ HP 色谱柱的入口带有塞子，出口带有卡断端。多孔的頂部和底部熔塊允許高流速。StrepTrap™ HP 屬於 HiTrap™ 系列預包裝色谱柱。

表 A4.3 (Appendix 4, Charistics of StrepTactin Sepharose High Performance products) 總結了預包裝 StrepTrap™ HP 色譜柱的特性。

圖 7.2. StrepTrap™ HP 1 mL 和 5 mL 色譜柱可快速方便地純化 Strep-tag II 重組蛋白，以高純度的濃縮形式和小容量進行純化。

樣品準備

根據結合緩衝液的成分（如下）調整樣品。例如，使用結合緩衝液稀釋樣品或使用脫鹽柱進行緩衝液交換（

結合緩衝液：	100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8 或 PBS (20 mM 磷酸钠、280 mM NaCl、6 mM 氯化钾)、pH 7.4
洗脱缓冲液：	2.5 mM desthiobiotin in binding buffer
0.5 M NaOH or 1 mM HABA (2-[4'-hydroxy-benzeneazo] benzoic acid) in binding buffer

Appendix 4 (Characteristics of StrepTactin Sepharose High Performance products) 以瞭解 StrepTrap™ 1 mL 和 5 mL 再生的詳情。

用於緩衝液製備的水和化學品應為高純水。

製備

1. 將結合緩衝液注入注射器或泵管。取下瓶塞，將色谱柱與注射器（使用提供的連接器）或泵管 「滴對滴 」連接，以避免將空氣引入色譜柱。
2. 用至少 5 個柱容量的蒸餾水或結合緩衝液洗掉乙醇。
3. 用至少 5 個柱容量的結合緩衝液分別以 1 mL/min 或 5 mL/min 的速度對 1 mL 和 5 mL 試劑柱進行平衡。
4. 使用與 Luer 接頭連接的注射器或泵將樣品注入色譜柱。
5. 使用 5 至 10 個柱容量的結合緩衝液清洗色譜柱，或直到洗出液中沒有任何物質為止。Chapter 11, Desalting/buffer exchange and concentration).
6. 洗脱后，可按照 Appendix 4 (Characteristics of StrepTactin Sepharose High Performance products).

通过将样品载量和流速提高五倍，可以轻松地将 StrepTrap™ HP 色谱柱从 1 mL 扩大到 5 mL。快速放大的另一種方法是串聯兩到三根 StrepTrap™ HP 色譜柱（背壓會增加）。

StrepTrap™HP色谱柱可快速使用，并可使用0.5 M NaOH轻松再生。

将StrepTrap™HP色谱柱储存在20%乙醇中，温度为2 °C至8 °C。

應用範例

1.快速有效的再生

使用氫氧化鈉（0.5 M NaOH）即可輕鬆完成 StrepTrap™ HP 的再生。在 大腸桿菌 裂解液中對甘油醛-磷酸氫化酶 (GAPDH)-Strep-tag II 進行了六次連續的純化，並在運行之間進行了再生（圖 7.3）。

目標蛋白的最終純度和收率幾乎相同，沒有降低的趨勢。根據 SDS-PAGE，純度在 95% 以上（圖 7.3），所有六次實驗的產率約為 0.85 mg（85%）。這些結果顯示，在重複使用 StrepTrap™ HP 並結合 0.5 M NaOH 再生時，具有很高的重複性。

圖 7.3. 在同一 StrepTrap™ HP 膠柱上重複純化與再生。SDS-PAGE 分析（還原條件，Coomassie 染色）在同一 StrepTrap™ HP 膠柱上進行六次純化後的洗脫池，包括在每次純化之間以 0.5 M NaOH 再生。

2.雙標記蛋白的兩步誘導純化提高純度

在大多數情況下，單步誘導純化可獲得足夠的純度。在大多數情況下，使用 StrepTactin Sepharose 對 Strep-tag II 融合蛋白進行單步純化可獲得足夠的純度。如果情況並非如此，解決方案是引入第二個抗體標記。在這個例子中，一個雙標籤的 Strep-標籤 II-（組氨酸）₆ 蛋白質（M_r ~15 400）在 E.大腸桿菌 中表達的蛋白質 (Mr ~15 400)。兩個步驟包括在 HisTrap™ HP 上進行 IMAC（使用 Ni Sepharose High Performance 預先包裝），然後在 StrepTrap™ HP 上進行 AC。由於高純度是成功進行功能研究的關鍵，因此將兩步法的純度結果與單獨的 IMAC 和 AC 步驟進行比較。所有運行均在 4 °C的ÄKTAxpress上進行。

使用條件如下：

Individual HisTrap™ HP purification
列： 樣品： 樣品容量: 結合緩衝液: 洗脱緩衝液: 流速: 系統：	HisTrap™ HP 1 mL Strep-tag II-(his)6 protein (Mr ~15 400) in E.coli lysate 15 mL 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.5 20 mM 磷酸鈉，500 mM NaCl，500 mM咪唑，pH 7.5 0.8 mL/min ÄKTAxpress
ÄKTAxpressIndividual StrepTrap™ HP purification
列： 樣品: 樣品容量： 結合緩衝液： 洗脱緩衝液： 流速： 系統：	StrepTrap™ HP 1 mL Strep -tag II-(his)-tag II-(his)6 protein (Mr ~15 400) in E.coli 裂解液 15 mL 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 2.5 mM desthiobiotin in binding buffer 0.8 ml/min ÄKTAxpress
兩步式 HisTrap™ HP 和 StrepTrap™ HP 純化
列： 樣品： 樣品容量： 結合緩衝液： 洗脱緩衝液： 流速： 欄： 樣品： 結合緩衝液：  洗脱緩衝液： 流速： 系統：	HisTrap™ HP 1 mL Strep -tag II-(組氨酸)-tag II-(histidine)6 protein (Mr ~15 400) in E.coli 裂解液 15 mL 20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 7.5 20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，500 mM 咪唑，pH 7.5 0.8 mL/min StrepTrap™ HP 1 mL 從 HisTrap™ HP 洗出的部分，1 mL 100 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8.0 2.5 mM desthiobiotin in binding buffer 0.2 mL/min ÄKTAxpress

SDS-PAGE分析（圖7.4）顯示，單獨的HisTrap™ HP純化得到了目標蛋白和一些不同的雜質（泳道3）。單獨使用 StrepTrap™ HP 也能得到目標蛋白質，這次只有一個雜質（泳道 6）。

這個例子清楚顯示了雙標記蛋白質純化方法的優點，尤其是在需要高純度的情況下。HisTrap™ HP 和 StrepTrap™ HP 在 ÄKTAxpress 上依次運行，滿足了對快速、高效層析系統的要求，能夠提供這樣的結果。

圖 7.4. SDS-PAGE 分析 (還原條件) 比較在 HisTrap™ HP 1 mL 和 StrepTrap™ HP 1 mL 上的單獨純化與在兩種色譜柱上的合併兩步純化。數據由瑞典斯德哥爾摩 Biovitrum 的 Martina Nilsson、Robert Svensson 及 Erik Holmgren 慷慨提供。

3.Scale-up from 1 mL to 5 mL to 29 mL column

在保持停留時間不變的情況下，可通過增加色譜床容積實現擴展。此方法可在放大過程中保持色譜性能。

使用的蛋白是雙標記螢光蛋白，(his)₆-mCherry-Strep-tag II (M_r 31 000)，在 E.大腸桿菌溶液中，可在 587 nm 和 280 nm 波長下檢測到。首先在 StrepTrap™ HP 1 mL 膠柱上進行純化，然後放大至 5 mL 膠柱，再進一步放大至 29 mL XK 26/20 膠柱，以高效能 StrepTactin Sepharose（床層高度 5.5 cm）填裝。所有色谱柱的停留时间均为2 min。图7.5 显示了色谱图和运行条件。

從 1 mL StrepTrap™ HP 色譜柱擴大到 5 mL 色譜柱時，蛋白質載量增加了 5 倍；從 1 mL StrepTrap™ HP 色譜柱擴大到 29 mL XK 26/20 色譜柱時，蛋白質載量增加了 25 倍。根據吸光度測量計算的產率分別為 2.2、9.4 和 52.7 mg（表 7.1）。

這些色譜柱的結果相當，證明從 StrepTrap™ HP 色譜柱擴大純化至更大的 XK 26/20 高性能 StrepTactin Sepharose 色譜柱是容易和可重複的。

表 7.1 StrepTrap™ HP 和 XK 26/20 色譜柱產量概觀

Column	產量 (mg)
StrepTrap™ HP, 1 mL StrepTrap™ HP, 5 mL XK 26/20 包裝 StrepTactin Sepharose High Performance, 29 mL	2.2 9.4 52.7

圖 7.5. 擴大 (His)6-mCherry-Strep-tag II 的純化，(A) StrepTrap™ HP 1 mL，(B) StrepTrap™ HP 5 mL，(C) StrepTactin Sepharose High Performance XK 26/20，床面高度 5.5 mL，29 mL。