使用 MISSION^® shRNA 進行新一代 RNA 干擾

Introduction

RNA干擾技術最早是在1998年的一項研究中出現的。Caenorhabditis elegans¹ 後來迅速演變成目前的形式，成為研究基因功能、生物通路和疾病生理學的革命性工具。早期在矮牵牛中的研究证明了一种现象（称为共抑制），即同源转基因的过度表达会导致转基因和内源基因的沉默。² C. elegans 後來的研究提供了突破性的實驗，清楚地確定雙鏈 RNA (dsRNA) 會干擾基因的功能。這個發現被稱為 RNA 干擾或 RNAi。

RNAi 技術的工作和改進不斷增加。我們現在已經知道內源 RNAi 通路的基本機制，知道這個通路存在於大多數的真核生物中，³ 以及如何利用細胞機器來沉默基因的表達。研究人員開發了使用小於 30 個碱基對 (bp) 的小型干擾 RNA (siRNA) 的關鍵規則和參數，允許在哺乳類動物細胞中使用這些 dsRNA⁴ 而不會觸發細胞的抗病毒反應機制。在轉染時，合成的 siRNA 會通過 RNase 酵素 Dicer 的裂解（圖 1），並被 RNAi-induced silencing complex (RISC) 所吸收。RISC 解開雙鏈 siRNA，活化的複合物與相關的反義 siRNA 鏈針對同源的 mRNA 轉錄本進行裂解和隨後的降解。轉錄本水平的降低會導致目標蛋白水平的降低，從而引起表型的改變。基因沉默或基因敲除可以使用 qRT-PCR 等方法在 mRNA 轉錄本層面進行檢測，或透過 Western 印跡、ELISA 等方法在蛋白質層面進行檢測，以及最近開發的以質譜法為基礎的蛋白質定量方法，例如 AQUA™ 技術。

圖 1. shRNA 和 siRNA 介導的基因沉默。細胞可直接轉染 MISSION shRNA 質粒，以進行瞬間或穩定的基因沉默，而 shRNA 慢病毒顆粒可用於轉染感興趣的細胞系。shRNA 在細胞核中轉錄後，髮夾會進入 RNAi 通路，被 Dicer 劈裂產生 siRNA。siRNA 被 RISC 識別，RISC 介導目標 mRNA 的裂解以達到基因沉默的目的。合成的 siRNA 可直接轉染，並在與 RISC 組合時進入 RNAi 通路。

進一步的進展顯示，siRNAs可以在宿主細胞內由DNA載體表達，提供長期沉默、誘導沉默的方法，以及可複製無限供應的質粒DNA格式。此外，這些以向量為基礎的 RNAi 平台可以與病毒傳輸系統整合，讓研究人員可以在無數的細胞系中執行基因敲除。最近對內源 microRNA (miRNA) 的研究顯示，可以使用合成的 miRNA 模擬物誘導 RNAi 通路，而不是直接使用標準的 21 bp siRNA 序列。這些合成形式的 miRNA 稱為短髮夾 RNA (shRNA)，由 pol II 或 pol III 啟動子表達。

討論

隨著 RNAi 方法組合的不斷擴大，即使是最複雜的研究系統也有了更多的選擇。直到最近，合成 siRNA 仍是最廣泛適用於各種系統和應用的 RNAi 媒介。由商業供應商設計及生產合成 siRNA，消費者只需很少的操作。只要系統容易轉染（如標準轉換細胞系），這種形式適用於任何規模的研究。然而，使用合成 siRNA 的障礙包括：它是一種不可再生的資源、沉默的瞬間性，以及在轉染原代細胞和非分裂細胞系（如神經元、淋巴細胞和巨噬細胞）時所面臨的困難。

對於那些面臨上述障礙的人來說，基於 DNA 載體的 shRNA 方法提供了必要的解決方案。 shRNA 表達載體能在大腸桿菌中繁殖，因此能提供無限量的 DNA 來進行轉染。此外，這樣的載體提供了穩定 shRNA 表達和基因沉默的可選擇標記。以質粒為基礎的系統最吸引人的特點之一是該技術與病毒傳輸系統的耦合。含有適當病毒包裝訊號和調控元件的載體可用來將 shRNA 序列包裝到感染性病毒中。如果進行適當的假型化，這些病毒粒子可以轉染更廣泛的細胞系，並克服標準轉染方法所面臨的問題。病毒傳輸系統已被廣泛研究用於基因治療研究，因此在安全性和使用上已經過許多修改。然而，考慮各種病毒系統的特性是很重要的。腺病毒和一些逆轉錄病毒（如慢病毒和小鼠幹細胞病毒 (MSCV)）是常用的病毒傳輸系統。腺病毒利用受體介導的感染，不會整合到基因組中進行穩定的沉默實驗，而 MSCV 則無法整合到神經元等非分裂細胞系中。以 VSV-G 包膜蛋白為假型的慢病毒系統，是最吸引人的病毒包裝與 shRNA 構建物傳輸系統。這是因為它具有廣泛的滋養性和非受體介導的傳輸，能夠整合到基因組中進行穩定的基因沉默，而且整合到基因組中不需要有絲分裂過程，因此可以同時用於分裂和非分裂的細胞系。此外，慢病毒系統不會引起免疫反應，因此可將脫靶效應的疑慮降至最低，並可在體內應用。

為了協助進一步開發和分發 RNAi 研究工具，Sigma-Aldrich 於 2005 年 3 月宣布加入並贊助 The RNAi Consortium (TRC)。TRC 是 Broad 研究所與來自哈佛醫學院、麻省理工學院、懷特海德研究所、丹納法伯癌症研究所、麻省總醫院、華盛頓大學和哥倫比亞大學的著名科學家及其實驗室之間的研究合作。除了 Sigma-Aldrich 之外，另外四家領先的生命科學研究機構也是贊助會員。The Broad Institute 和 TRC 的使命是為基因組醫學創造全面的工具，讓全世界的科學家都能廣泛使用，並開創這些工具在疾病研究上的應用。三年來，聯盟的目標是建立一個全面的 RNAi 試劑庫（以向量為基礎的 shRNA 克隆），旨在敲除人類和小鼠基因的表達，從而使科學家能夠闡明正常生理和疾病中的基因功能。

作為科學合作者和商業夥伴，Sigma-Aldrich 將協助 TRC 開發、製造和全球銷售以人類和小鼠慢病毒載體為基礎的 shRNA 文庫 (MISSION™ shRNA)。該文庫由麻省理工學院和哈佛大學的 Broad 研究所設計和開發，目前正在擴大到針對 15,000 個註釋人類基因 (MISSION TRC-Hs1.0) 和 15,000 個註釋小鼠基因 (MISSION TRC Mm1.0) 的 150,000 個克隆。目前約有 50,000 個針對 7,100 個人類基因和 2,900 個小鼠基因的克隆可供使用。

MISSION^® shRNA 構建物是使用專利演算法設計的，該演算法會根據核苷酸含量、在靶基因內的位置，以及透過 BLAST 搜尋的序列特異性來評分可能有效敲除內源基因的序列，以盡量減少脫靶效應。多達五個 shRNA 序列被單獨克隆到 pLKO.1-puro（圖 2）中，以廣泛覆蓋每個目標基因並達到不同程度的基因敲除效果（圖 3A 和 3B）。髮夾結構包括分子內 20-21 bp 的莖和 6 個碱基迴圈，經由宿主細胞中的 U6 (pol III) 啟動子表達時，會被 Dicer 識別並切割。所產生的 siRNA 雙工體接著會與 RISC 結合，繼續進行 RNAi 通路。嘌呤霉素抗性标记用于哺乳动物细胞中的稳定选择，而氨苄西林抗性标记用于质粒在大肠杆菌中的繁殖。

圖 2. pLKO.1-puro 向量。

這些構建物可用於哺乳動物細胞的瞬間或穩定轉染。此外，pLKO.1-puro 的特點允許生成慢病毒粒子用於感染各種細胞。5′ 長末端重複 (LTR)、SIN/LTR (3′ LTR) 和 Psi 包裝信號允許使用 2- 質粒或 3- 質粒慢病毒包裝系統進行病毒包裝。⁵ 使用這種多質粒方法，產生的病毒粒子無複製能力，無法繁殖，有助於粒子的安全使用。^6,7 另外，3′LTR（SIN/LTR）U3 區域的缺失不會影響包裝過程中病毒基因組的產生，但會導致病毒 LTR 轉移到目標細胞後失去轉錄能力。此特性也有助於降低出現具有複製能力病毒粒子的風險，並避免與啟動子干擾有關的問題。最重要的是，整合的 U6 促動子和 shRNA 序列可以在目標細胞系中穩定表達。

圖 3A. MAPK 1 基因沉默。使用人類 Mitogen-Activated Protein Kinase 1 (MAPK 1, NM_138957) MISSION shRNA 集（5 個單獨的髮腳）在包裝細胞中產生慢病毒顆粒。用含有 shRNA 序列的慢病毒粒子感染 HEK 293T 細胞。感染後 72 和 144 小時，純化總 RNA 並使用適當的 TaqMan™ 基因表達分析法進行分析。感染樣本與未感染對照細胞之間的 Ct 差異以及 PCR 的效率被用來產生百分比表達水平。百分比表示為對照的水平 (100%)。

圖 3B. JAK 1 基因沉默。使用人類 Janus Kinase 1 (JAK 1, NM_002227) MISSION shRNA 組（4 個獨立的髮腳）產生慢病毒顆粒並如上感染 HEK 293T 細胞。感染後 72 小時和 144 小時的總 RNA 也使用相同的程序進行分析。所示結果顯示，與對照水平相比，shRNA 建構物會產生 JAK 1 基因沉默。

Summary

RNAi技術是過去十年來重要的生物學突破之一，它為基礎生物學、基因功能研究帶來了革命性的改變，它也有希望為藥物發現和治療帶來革命性的改變。合成 siRNA 提供了研究真核生物系統所需的基因工具，而這些系統以前是很難研究的。

MISSION預克隆的 shRNAs 克服了這些問題，它提供了長期沉默和表型觀察的系統、無限繁殖的質粒、瞬態或穩定轉染的選擇，以及產生慢病毒粒子用於感染和整合原代細胞、分裂細胞和非分裂細胞的能力。Sigma-Aldrich 致力於為您的 RNAi 研究需求提供無與倫比的基礎設施和服務。

 

RNAi Consortium shRNA 文庫由麻省理工學院授權製作和分發。

參考資料

1. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391(6669):806-811. https://doi.org/10.1038/35888

2. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. 1990. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. The Plant Cell. 2(4):279. https://doi.org/10.2307/3869076

3. Hannon GJ. 2002. RNA interference. Nature. 418(6894):244-251. https://doi.org/10.1038/418244a

4. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. 2001. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411(6836):494-498. https://doi.org/10.1038/35078107

5. STEWART SA. 2003. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. 9(4):493-501. https://doi.org/10.1261/rna.2192803

6. Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D. 1997. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15(9):871-875. https://doi.org/10.1038/nbt0997-871

7. Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, Trono D. 1998. Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery. J. Virol.. 72(12):9873-9880. https://doi.org/10.1128/jvi.72.12.9873-9880.1998