寡核苷酸純化

節目概觀

• 寡核苷酸純化的重要性
• 下一代測序 Oligos 的純化挑戰
• 寡核苷酸純化方法建議

寡核苷酸純化的重要性

寡核苷酸純化是將合成的寡核苷酸（DNA 或 RNA 的短序列）從不完整序列、鹽類或有機副產品等雜質中分離出來的過程。這些雜質產生於寡核苷酸的化學合成過程中，會影響最終產品的品質。選擇最佳的寡核苷酸純化技術取決於寡核苷酸的類型和應用。最佳的純化技術具有顯著的性能優勢，包括：

提高準確性

雜質會干擾下游應用，例如 PCR、測序或基因編輯。純化的寡核苷酸可確保與目標序列結合時具有更高的特異性和準確性。¹

增強性能

高純度寡核苷酸可提高分子診斷和研究檢測（如 qPCR 和雜交）的結合效率。²

降低背景雜訊

去除寡核苷酸生產副產品中的污染物，可將分子實驗中的背景信號降至最低，從而獲得更精確的結果。³

實驗的一致性

寡聚物純化可確保研究的再現性，這對於在多次測試中產生可靠、一致的結果至關重要。⁴

常見的純化方法包括脫鹽、盒式、HPLC (高效液相層析) 和 PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳) 純化。

寡核苷酸雜質的來源與純化選項

與成長中的鏈結合。a href="/TW/zh/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis">亞磷酰胺化學依序耦合到生長鏈上。在每個耦合週期中，低百分比的寡核苷酸鏈不會延伸，導致全長 (n) 和截短 (n-1, n-2, 等等) 序列 ('shortmers')的混合物。

在裂解、去保護和脫鹽（去除小分子雜質）之後，額外的純化可以將所需的全長序列從不想要的短序列中分離出來。

特定技術/應用 (表 1)所需的純度取決於短聚物存在所造成的潛在問題。

此外，包含常見修飾的寡核苷酸，例如生物素、氨基 C2 dT 等，可以使用下述任何方法來純化。對於含有較複雜染料結構的寡核苷酸，例如 ROX™、TxRd (Sulforhodamine 101-X) 等，HPLC 是首選的方法；只有 HPLC 才能去除游離染料，否則會干擾預期技術/應用的執行。

表 1. 按技術/應用推薦的純化方法。

Application	Desalt	Cartridge	HPLC
適用範圍標準PCR及RT-PCR	X	X
測序引物/探針	X
qPCR探針			X
克隆			X
微陣列	X	X	X
siRNA篩選	X	X
反义			X
生物工程			X
結晶學, 核磁共振			X
體內應用		<	X	X
NGS適配器

Oligo 純化方法說明

透過脫鹽法進行 Oligo 純化

脫鹽法可去除小分子雜質，如磷酸二酯骨架脫保護時產生的丙烯腈，這些雜質是裂解和脫保護過程中殘留的副產物。例如：因磷酸二酯骨架的脫保護而產生的丙烯腈，這些都是裂解和脫保護的殘留副產品。對於包括 PCR 在內的許多技術/應用而言，≤35 個碱基的寡核苷酸是可以接受脫鹽的，因為全長序列的龐大數量超過了短序列的貢獻 (進一步瞭解 產量計算）。寡核苷酸 >35個碱基可能需要額外的純化，例如Reverse-Phase Cartridge (Cartridge)。

純淡鹽純化無法提供保證的純度等級，因為此程序無法去除短聚物。

使用濾芯進行寡核苷酸純化

在反相濾芯上進行分離可提供更高的純度 (圖 1)。分離的基礎是全長序列 (具有疏水的 5'-DMT 基團) 和短序列 (不具有 5'-DMT基團）。全長序列會保留在色譜柱上，而短序列則會被洗掉。在濾柱上裂解 5'-DMT 之後，預期的全長序列會被洗提並回收。

隨著寡核苷酸長度的增加，含有5'-DMT基團（未封裝序列產生的產物）的短聚合物比例也會增加。這些不想要的序列無法透過盒式純化去除，因此，對於較長的寡核苷酸，建議使用高效液相層析 (HPLC) 或聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)。盒式純化無法保證純度。

使用 RP-HPLC 進行寡核苷酸純化

反相高效液相層析 (RP-HPLC) 的運作原理與反相濾盒相同 (圖 1)。然而，更高的解析度可達到更高的純度。RP-HPLC 是含染料的寡核苷酸的有效純化方法，因為其固有的疏水性可將所需序列與缺少染料的序列、短序列及有缺失的短序列極佳地分離出來。此外，RP-HPLC 因其色谱柱的容量和分辨特性而成为大规模合成的首选方法。然而，基於疏水性的解析度會隨著寡核苷酸的長度而降低。因此，通常不建議使用 RP-HPLC 純化 50 個基本位元的寡核苷酸。

標準 RP-HPLC 的純度通常可達到 85% 的全長序列（透過分析 HPLC）。根據序列的組成，可能會達到更高的純度。有關 RP-HPLC 所提供純度的確切性質以及任何相關費用，請向您當地的專業銷售或客戶服務人員洽詢。

圖 1. 透過反相進行分離：濾餅和 HPLC。

1. 進入色譜柱後，所需序列的疏水性 5'-DMT 會吸附在固定相樹脂上。
3. 沒有 5「-DMT 並因此無法與樹脂互動的短聚物會被流動相沖洗掉。
4. 5」-DMT 被裂解，所需的序列被洗出。

利用 IE-HPLC 純化寡核苷酸

離子（特別是陰離子）交換高效液相層析法 (IE-HPLC) 是根據寡核苷酸骨架中帶電基團（磷酸鹽）的數量來進行純化。陰離子交換法是在季銨固定相上使用鹽梯度流動相 (圖 2)。此方法的解析度極佳，適合較少量的純化。然而，IE-HPLC 受到長度的限制，通常最長為 40 個碱基。

使用 IE-HPLC 而非 RP-HPLC 的主要原因是為了純化具有顯著次級結構的寡核苷酸，這通常出現在具有高 GC 含量的序列中。IE-HPLC 對這類寡核苷酸很有效，因為流動相的 pH 值是高鹼性，會破壞氫鍵，因此也會破壞次級結構。此技術之後可以使用 RP-HPLC 來增加分離過程的第二層次。請洽詢保證百分比的全長序列。

圖 2. 透過 IE-HPLC 進行分離。

1. 進入色譜柱後，粗混合物的多離子磷酸鹽會與多陽離子固定相樹脂形成電荷-電荷互動。
2. 當流動相的離子強度增加時，短分子會被洗掉。
3. 在更高的離子強度下，較長的所需序列會最後洗掉。

利用 PAGE 純化寡核苷酸

聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE) 利用變性環境，根據分子量而非電荷來分離寡核苷酸 (圖 3)。在適當的條件下，相差一個碱基的寡核苷酸也能被分離出來。這種優異的尺寸解析度，通常可使任何可用的純化方法達到最高的純度水準。由於萃取寡核苷酸的程序複雜，因此 PAGE 的最低產量比其他方法低。當需要高純度且序列≥50 個基本位元時，建議使用此技術。PAGE 的純度通常可達到 95% 的全長序列。有關 PAGE 所提供純度的確切性質以及任何相關費用，請向您當地的專業銷售或客戶服務人員洽詢。

圖 3. 透過 PAGE 進行分離。在凝膠上施加電場，使多離子寡核苷酸移向帶正電的陽極。由於電荷均勻地分布在粗混合物中，因此各種序列會根據分子量（即長度）分離。較短的序列移動較快，而較長、所需的序列移動較慢。

透過凝膠過濾進行寡核苷酸純化

建議用於體內實驗的較小規模寡核苷酸進行凝膠過濾（圖 4）。硫代磷酸寡核苷酸 (S-Oligos) 通常用於體內反意義研究，視製造地點而定，可能會進行凝膠過濾（請向當地銷售或客戶服務專業人員查詢您所在的地區是否有這種處理方式）。此純化過程可去除微量的合成、裂解和脫保護副產物（標準脫析過程未去除），以及純化溶劑。這些微量的副產品在體外通常是無害的，但在體內可能會導致細胞毒性。

圖 4. 通過凝膠過濾進行分離。凝膠過濾的純化過程中，序列上沒有 5'-DMT 的存在。

1. 進入色譜柱時，所需的序列與各種副產品和溶劑雜質的混合物會穿越固定相樹脂。
2. 當流動相流動時，較小的雜質會進入凝膠孔，從而減慢它們通過基質的速度；所需序列不會進入凝膠孔，因此會首先通過基質洗脫。
3. 雜質最終通過凝膠孔和基質，並被洗掉。

下一代測序寡聚體的純化挑戰

上述傳統純化方法可有效去除小分子雜質，並將全長序列百分比提高到理想的水平。⁵ 傳統的純化方法無法有效去除交叉污染的寡核苷酸。少量的交叉污染是任何高通量寡核苷酸製造設施的現實。通常情況下，這種少量的交叉污染對 PCR 等傳統技術/應用沒有明顯的影響。然而，大多數 NGS 平台依賴索引（條碼）適配體進行多工。如果少量錯誤的條碼（由於交叉感染）被加入到錯誤的測序目標上，直到資料分析階段才會發現問題，這使得這個問題在時間和金錢上的成本都很高。Next-Gen Sequencing Oligos (NGSO) 的開發就是為了避免這個問題。

寡核苷酸純化方法建議

寡核苷酸的最佳純化方法是根據預期用途使用不同的方法或方法組合。首先，請參閱 表 1，以瞭解基於技術/應用的推薦方法。此外，請至 oligotechserv@sial.com 網站諮詢我們的技術服務團隊，以最佳化您的寡聚物純化方法。我們擁有 35 年以上設計、製造、修改及純化 DNA 與 RNA 寡聚物的經驗。

參考資料

1. 02-04-2008. Oligonucleotide synthesis: methods and applications. [dissertation]. Springer Science & Business Media: Herdewijn P, editor.

2. Beaucage S, Caruthers M. 1981. Deoxynucleoside phosphoramidites—A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters. 22(20):1859-1862. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)90461-7

3. Goodchild J. 1990. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjugate Chem.. 1(3):165-187. https://doi.org/10.1021/bc00003a001

4. Caruthers MH. 1985. Gene Synthesis Machines: DNA Chemistry and Its Uses. Science. 230(4723):281-285. https://doi.org/10.1126/science.3863253

5. Luthra R, Chen H, Roy-Chowdhuri S, Singh R. Next-Generation Sequencing in Clinical Molecular Diagnostics of Cancer: Advantages and Challenges. Cancers. 7(4):2023-2036. https://doi.org/10.3390/cancers7040874