DNA 和 RNA 定量

準確測定核酸濃度和產量對下游應用非常重要，包括轉染、克隆、PCR 和下一代測序 (NGS)。這些應用通常有特定的目標核酸濃度，以達到最佳效能。定量不準確會增加下游檢測的變異性，並影響結果的品質。DNA 和 RNA 定量可使用下列任何一種方法：

• 琼脂糖凝膠電泳
• qPCR

DNA 定量使用 UV 吸光度

最常用於測定核酸濃度和純度的技術是吸光度。吸光度測量可用於估計純化樣本中 DNA 或 RNA 的濃度。在此方法中，核酸樣品會被放入石英比色皿中，然後再放入紫外分光光度計內。NanoDrop™ 儀器、DeNovix DS-11 分光光度計和 Blue-Ray Bio EzDrop 分光光度計等小容量分光光度計可使用基座分析低至 1 µL 的樣品容量。紫外光以指定的路徑長度通過樣品，利用 Beer-Lambert 方程在 260 nm 處對照空白測量吸光值，即可直接計算核酸的濃度：

A = εcl

其中：

A = 紫外吸收率
ε = 波長依賴的消光係數
c = 核酸濃度
l = 光路徑 (cm)

消光係數*：

• dsDNA（純）：0.020 (µg/mL)^-1 cm^-1
• ssDNA (pure)：0.027 (µg/mL)^-1 cm^-1
• ssRNA (pure)：0.025 (µg/mL)^-1 cm^-1

*請注意，此公式僅適用於核苷酸比例組成的大型核酸分子，例如基因組 DNA 或質粒。對於寡核苷酸和其他短核酸分子（如 miRNA），消光係數應根據寡核苷酸的序列來計算。

為了提高準確性，A₂₆₀ 測量通常會根據渾濁度（以 320 nm 的吸光度測量）使用以下公式進行修正：

濃度 (µg/mL) = (A₂₆₀ measurement - A₃₂₀

****dsDNA 的轉換因子：50 µg/mL
***ssDNA的轉換因子：37 µg/mL
***ssRNA的轉換因子：40 µg/mL

然後，將核酸濃度乘以最終的總純化樣品體積，即可獲得總產率。

DNA 收率 (µg) = DNA 濃度 × 樣品總容量 (mL)

吸光度測量、污染物和核酸純度

除 DNA 或 RNA 外，其他分子也可以在 260 nm 範圍內吸收光線。蛋白質中具有芳香環的氨基酸會在 280 nm 波長吸收光線，這會影響 260 nm 波長的吸光度測量。此外，在矽基 DNA 和 RNA 純化方法中常用於結合的胍和其他混沌鹽或溶劑的存在，會在 230 nm 處吸收光線，並會透過交叉作用導致較高的 260 nm 吸光度量測。

要評估蛋白質污染，可判斷 260 奈米吸光度（核酸吸光度）與 280 奈米吸光度（蛋白質氨基酸中芳香環的吸光度，不過苯酚也會在 280 奈米吸光）的比值。高品質 DNA 的 A₂₆₀/A₂₈₀ ratio 為 1.7-2.0。高品質 RNA 的 A₂₆₀/A₂₈₀ ratio 為 ~2.0。

DNA 純度 (蛋白質污染物) = A₂₆₀ 讀數 ÷ A₂₈₀ 讀數

要評估化學污染，可使用 260 nm 和 230 nm 的吸光度比值。殘留的混沌鹽和有機溶劑會抑制 PCR，已知它們會在 230 nm 範圍內吸收光線。A₂₆₀/A₂₃₀ ratio 應為 >1.5，用於對化學干擾敏感的應用，包括以酶為基礎的檢測，如 qPCR 和測序。比率越低，製劑中有機化合物或混沌鹽的含量就越高。

DNA 純度（化學雜質）= A₂₆₀ 讀數÷A₂₃₀ 讀數

用於定量的螢光計量分析方法

螢光計量分析方法被廣泛認為是可用於核酸定量的一些最靈敏的方法。這些方法使用的螢光染料可夾雜並結合核酸溝槽、非特異性結合 DNA 或 RNA，或選擇性結合核材料。

每種核酸染料都有特定的激發和發射波長。使用螢光儀測量 DNA 或 RNA 樣品，然後將樣品的螢光發射與使用已知核酸濃度標準產生的螢光曲線進行比較，計算出核酸濃度。不同的樣本類型（基因組 DNA、質粒 DNA 等）各自需要自己的標準曲線。與吸光法一樣，計算出的濃度必須根據需要修正稀釋因子。

選擇螢光核酸染料進行定量時的注意事項：

• 特異性： 不同的染料針對測量dsDNA、ssDNA、RNA或小RNA（例如、miRNA）的結合機制和光譜特性 - 請確保您選擇的螢光染料能與您感興趣的目標結合


• 靈敏度： 高靈敏度的螢光染料可讓您使用較少的樣品或測量極低濃度的核酸


• 動態範圍： 有些試劑可用於檢測低濃度的核酸，但在較高濃度時可能會失去線性；使用的試劑必須適合您樣品的預期濃度範圍


• 樣品容量： 如果您的樣品容量有限，請注意試劑或試劑盒所要求的樣品容量


• 樣品格式： 有些試劑和試劑盒經過優化，適合在單管或比色皿中進行測量，而有些試劑和試劑盒則適合在微孔板中使用，以獲得更高的通量


• 儀器過濾器： check if your fluorometer has suitable excitation and emission filters for the selected dye

DNA and RNA quantitation by gel electrophoresis

由於瓊脂質凝膠電泳可將 DNA 和 RNA 與其他雜質分離，因此此定量方法可消除一些與根據吸光度測量進行計算相關的問題。在瓊脂質凝膠電泳中，將分離出的 DNA 或 RNA 樣品載入瓊脂質凝膠的孔中，然後將其置於電場中。帶負電的核酸會向陽極移動，從而根據大小和形狀分離 DNA 和 RNA 片段。瓊脂凝膠電泳的另一個好處是可以觀察樣本中的污染帶和剪切雜質。核酸濃度和產量可透過比較樣品帶的強度和已知量的標準來判定。由於 DNA 和 RNA 會在 260 奈米處吸收光線，因此可使用紫外透射照度計測量濃度。使用核酸染料（如溴化乙锭或 SYBR® Green）標記核酸樣品和標準品並在該染料的指定波長下測量濃度，可以獲得更高的靈敏度。如果載入凝膠的 2 µL 未稀釋 DNA 樣品的濃度與 100 ng 標準品的濃度相同，則樣品濃度為 50 ng/µL（100 ng ÷ 2 µL）。用於定量的標準品應與被分析的樣本核酸大小相同，且標籤相似。

圖 1. 對製備好的 DNA 進行琼脂糖凝膠電泳。前四條泳道顯示製備中有較大剪切或低分子量的核酸污染物。

即時 PCR (qPCR) 定量

即時 PCR 或定量 PCR (qPCR)，使用在 PCR 退火階段結合目標 DNA 的螢光探針，或結合雙鏈 DNA 的螢光染料。裝有螢光偵測模組的專用熱循環儀可用來監控擴增過程中的螢光訊號。測得的螢光與 DNA 的總量成正比。標準曲線可用於確定測試樣本中目標 DNA 的數量。

在 RNA 定量的情況下，PCR 模板是互補 DNA (cDNA)，它是由 RNA 反轉錄獲得的。

實時 PCR 的一個主要優勢是能夠根據可擴增核酸的數量來量化特定的目標序列。這在量化基因組 DNA 時很有優勢，因為在測量時會忽略樣本中存在的剪切 DNA 和較小 DNA 及 RNA 片段的數量。其他優點還包括檢測反應混合物中的抑制劑，以及螢光探針固有的特異性。

圖 2. 使用 SYBR Green 螢光染料和 10 倍稀釋的模板進行定量 PCR (qPCR)。

結論

適當的 DNA 或 RNA 定量方法應根據許多因素來選擇，包括設備的可用性、預定的下游應用和產量。有些定量方法的額外好處是可測定樣品的生物和化學純度。在比較不同方法的產量時應小心謹慎，因為污染物的存在可能會干擾測量，導致產量被高估或低估。