使用基於肝素的 Cytiva 產品分離 DNA 結合蛋白質

DNA結合蛋白形成了一個極為多樣化的蛋白類別，它們有一個共同的特徵，就是能夠與DNA結合。從功能上來看，這一類蛋白可分為負責 DNA 複製和定向的蛋白，如組蛋白、核小體和複製酶，以及參與轉錄的蛋白，如 RNA/DNA 聚合酶、轉錄激活劑和抑制劑以及限制酵素。它們可以被製成融合蛋白，以進行更高規格的純化（第 42 頁，GST 融合蛋白），但它們結合 DNA 的能力也能讓使用肝素作為配體的群體規格化純化得以實現。肝素是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，能夠結合非常廣泛的生物分子，包括：

• DNA結合蛋白，例如啟動因子、延伸因子、限制性內切核酸酶、DNA連接酶、DNA 和 RNA 聚合酶。
• 血清蛋白酶抑制劑，如抗凝血酶 III、蛋白酶nexins。
• 酶，如肥大細胞蛋白酶、脂蛋白脂肪酶、凝血酶、超氧化物歧化酶。
• 生長因子，如破壞細胞生長因子、施萬細胞生長因子、內皮細胞生長因子。
• 細胞外基質蛋白，如槲皮素、槲皮素、層黏蛋白、凝血酶、膠原蛋白。
• 荷爾蒙受體，如雌激素和雄激素受體。
• 脂蛋白。

肝素的結構如圖 1所示。

1. 在與 DNA 結合蛋白的互動中，肝素模仿核酸的多離子結構。
2. 在與凝血因子（如抗凝血酶 III）互動時，肝素可作為抗凝配體。

圖 1. 由交替的六壬酸 (A) 和 D-葡萄糖胺殘基 (B) 組成的肝素多醣體結構。六壬酸可以是 D-葡萄糖醛酸（上圖）或其 C-5 縮合物 L-尿醛酸（下圖）。

R₁ =-H或-SO₃^-, R₂ =-SO₃^- or -COCH₃

純化選項

	結合能力	最大作業流量	備註
牛抗凝血酶III，3 mg/柱 牛抗凝血酶III，15 mg/柱	預製柱。
	HiPrep 16/10 Heparin FF	預製20 毫升柱。
Bovine antithrombin III, 2 mg/mL medium	400cm/h*	以可供柱填料的懸浮液形式提供。
* 請參閱附錄 4，將線性流速 (cm/h) 轉換為容積流速。最大操作流量是在床高 10 cm、內孔距 5 cm 的填料柱中測量計算出來的。

純化範例

圖2、3和4顯示不同DNA結合蛋白純化條件的範例。

圖 2. 在 HiTrap Heparin HP 上部分純化重組 HIV 反轉錄酶。

圖 3. 使用 HiTrap Heparin HP（5 mL）對重組 DNA 結合 Oct-1 蛋白（由瑞典 Uppsala 大學醫院 Gunnar Westin 博士提供）進行部分純化。

圖 4. scCro8 在 HiPrep 16/10 Heparin FF 上進行純化。

進行分離

結合緩衝液：20 mM Tris-HCl，pH 8.0 或 10 mM 磷酸钠，pH 7.0

洗脱緩衝液：20 mM Tris-HCl，1-2 M NaCl，pH 8.0 或 10 mM 磷酸钠，1-2 M NaCl，pH 7.0

1. 用 10 柱体积的结合缓冲液平衡色谱柱。
2. 用 5-10 柱容量的結合緩衝液清洗，或直到洗出液中沒有物質出現為止（在 A_{280 nm} 處通過 UV 吸收進行監測）。
3. 使用 5-10 柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱缓冲液浓度从 0-100% 连续梯度或阶梯梯度。

通过改变缓冲液的 pH 值或离子强度来调节肝素的选择性。使用 NaCl、KCl 或 (NH₄)₂SO₄  高達 1.5-2 M 的連續或梯度洗脫。

清洗

用 0.5 柱容量的 2 M NaCl 洗 10-15 分鐘，去除離子結合蛋白。

用 4 柱容量的 0.1 M NaOH 1-2 小時，或 2 柱容量 6 M 氫鹽酸胍 30-60 分鐘，或 2 柱容量 8 M 尿素 30-60 分鐘。

用 4 支柱容量 0.1% - 0.5% Triton X-100 洗滌 1-2 小時，去除疏水結合的蛋白質。

	配體密度	成分	pH穩定度*	平均粒徑
HiTrap Heparin HP	10 mg/mL	HiTrap Heparin HP	10mg/mL	肝素通過還原胺化與高效能 Sepharose™ 結合，即使在鹼性條件下也能提供穩定的附著。
肝素 Sepharose 6 Fast Flow   HiPrep 16/10 Heparin FF	肝素透過還原胺化與Sepharose 6 Fast Flow結合，即使在鹼性條件下也能提供穩定的附著。	*長期是指pH值間隔，介質在此間隔內長時間保持穩定，不會對其後續色譜性能產生不良影響。短期是指再生、就地清潔和消毒程序的 pH 間隔。

化學穩定性

0.1 M NaOH（+20 °C，1 周），0.05 M 醋酸鈉，pH 4.0，4 M NaCl，8 M 尿素，6 M 鹽酸胍。

儲存

用含有 20% 乙醇的 0.05 M 醋酸鈉清洗培養基和色譜柱（使用約 5 個色譜柱容量的包裝培養基），並儲存於 +4 至 +8 °C。

材料

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