蛋白質 A 標記蛋白的純化

含有蛋白A標記的重組標記蛋白可在IgG Sepharose^® 6 Fast Flow上純化。AC 媒介基於 Sepharose^® 6 Fast Flow 矩陣，並與人類 IgG 共價耦合。這種Fast Flow培養基的機械特性允許高流速（高達400 cm/h）用於原核生物表達系統中生產的蛋白A標記蛋白結合物的快速方便的單步純化。

IgG Sepharose^® 6 Fast Flow 也適用於蛋白複合物的串聯抗體純化 (TAP)。

另一種洗脫液為 0.1 M glycine-HCl，pH 3.0。

IgG Sepharose^® 4 Fast Flow 的特性如 表 1 所示。

表 1. IgG Sepharose^® 6 Fast Flow 的特性

配體	組成	pH穩定性*	粒子大小
人多克隆IgG	用溴化氰法將IgG耦合到Sepharose® Fast Flow上。	短期 3-10 長期 3-10	90微米

* 短期是指再生、原位清潔和消毒程序的 pH 間隔。

使用IgG Sepharose^® 6 Fast Flow進行分離

。

緩衝液製備

結合緩衝液： 洗滌緩衝液： 洗脱緩衝液： 中和緩衝液：

0.05 M Tris-HCl，0.15 M NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.6 5 mM 醋酸銨，pH 5.0 0.5 M 醋酸，用醋酸銨調整成 pH 3.4 1 M Tris-HCl，pH 9.0

製備

1. 包裝柱（Characteristics of Dextrin Sepharose High Performance products），並用至少 5 柱容量的結合緩衝液清洗。
2. 用約 5 柱容量的結合緩衝液平衡色譜柱。
3. 用 2-3 柱容量的醋酸清洗，然後用 5 柱容量的結合緩衝液清洗。
4. 上樣。
5. 用 10 個柱容量的結合緩衝液洗柱。
6. 用 2 個柱容量的洗滌緩衝液洗柱或直到洗出液中沒有物質出現（由 A280 nm 的 UV 吸光度決定）。
7. 用 2-5 柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。*
8. 立即用结合缓冲液重新平衡色谱柱，直到洗脱液的 pH 值达到 7.0（IgG 可能会在较低的 pH 值下变性）。

* 由於洗脫條件相當苛刻，建議收集馏分至中和緩衝液（60 µL - 200 µL 1 M Tris-HCl，pH 9.0 per ml fraction），使馏分的最终 pH 值接近中性。
这种方法虽然可以得到浓缩的洗脱液，但只有在融合产物在酸性条件下稳定的情况下才能使用。

表 2. 顯示在發酵過程中，可自動線上監控分泌型融合蛋白的產量。融合蛋白 ZZ-IGF-1 是胰島素樣生長因子 1 與蛋白 A 的衍生物融合（命名為 ZZ），在大腸桿菌中表達。

Column:	IgG Sepharose® 6 Fast Flow (0.5 × 2.5 cm)
樣品：	含 ZZ-IGF-1 融合蛋白的細菌懸浮液，自動從發酵肉湯取樣，500 µl
結合緩衝液：	0.05 M Tris-HCl, 0.05% Tween 20, pH 7.6
洗滌緩衝液：	10 mM 醋酸銨，pH 4.6
洗滌緩衝液：	0.2M乙酸，pH 3.2

圖 1. 發酵過程中某個時間點所取樣品的色譜圖。(B) 自動監測發酵過程中產品濃度的結果。ZZ-IGF-1 的濃度是透過整合每次色譜分析時所獲得的 ZZ-IGF-1 峰值來決定。細菌密度在 A600 nm 處以手動方式測量。

化學穩定性

避免使用還原劑，如 2- 巯基乙醇或 DTT，因為它們可能會破壞 IgG 配體中的二叉鍵。

儲存

在中性pH下，用5柱容量的20%乙醇清洗，並儲存於+4 °C至+8 °C。