使用 Sephadex^® 進行分離

為了防止可能的離子相互作用，建議在脫鹽過程中和最終的樣品緩衝液中使用低鹽濃度（25 mM 氯化鈉）。如果需要避免氯化鈉的存在，可使用 100 mM 乙酸銨或 100 mM 碳酸氫銨等揮發性緩衝液。

樣品應完全溶解。離心或過濾以去除微粒物質（附錄 3）。

當使用一般水性緩衝液時，樣品濃度高達 70 mg/mL 蛋白質應該不會影響分離。

如果可能的話，使用同時具有 UV 和電導監測器的色譜系統，以方便優化樣品載量。A₂₈₀ 處蛋白質峰的洗脫和鹽峰的出現可以被精確地跟蹤，不同的分離結果可以很容易地被比較，如 圖5所示。6.

如果無法監控電導率，且回收完全脫盐的樣品是主要要求，則應使用總柱容積 15%到 20%的樣品量。

圖 5.6. 小鼠血漿在 HiPrep™ 26/10 除膠上的緩衝區交換。

一般注意事項

小規模的樣品脫鈣

樣品容量從 0.2 到 2.5 mL，可以使用 PD-10 Desalting、PD MidiTrap™ G-25 和 PD MiniTrap™ G-25 色譜柱並行運行多個樣品。這些色譜柱有兩種不同的使用方式：一種是在實驗室工作台上手動使用，另一種是結合 Spin Adapter 與標準離心機一起使用。對於較小的蛋白質 (M_r > 700)，可使用 PD MiniTrap™ G-10 和 PD MidiTrap™ G-10 色譜柱。

對於 70 至 130 μL 範圍內的較小樣品容量，可將多個樣品與微離心機或 PD MultiTrap™ G-25 96 孔板一起運行於 PD SpinTrap™ G-25 自旋柱上，使用離心法進行提取。雖然可以執行，但不建議使用真空的 PD MultiTrap™ G-25，因為與使用離心的操作相比，重現性會降低。

使用HiTrap^® 和HiPrep™色谱柱去除大容量样品

最多串联三根HiTrap^® 脱盐色谱柱，以增加样品容量。

最多可串联四根 HiPrep™ 26/10 除盐柱以增加样品容量。例如，兩根柱的樣品容量為 30 mL，四根柱的樣品容量為 60 mL。

缓冲液制备

对于携带带电基团的物质，建议使用含有缓冲盐的洗脱液。建議鹽濃度至少為 150 mM，以防止可能與層析介質產生的離子相互作用。氯化鈉通常用於此目的。通常 25 至 50 mM 濃度的緩衝物質就足夠了。在鹽濃度超過 1 M 時，疏水性物質可能會被阻滯或與層析介質結合。

在更高的鹽濃度（> 1.5 M 硫酸銨）下，色譜柱填料會縮小。

樣品準備

只要粘度與所用緩衝液的粘度相差不超過 1.5 倍，樣品濃度就不會影響分離。這相當於使用一般水性緩衝液時，蛋白質的最大濃度為 70 mg/mL。樣品應完全溶解。如有必要，上樣前應立即離心或過濾（0.45 μM過濾器），以去除微粒物質。

緩衝液交換

蛋白質的溶解度通常取決於pH值和/或離子強度（鹽濃度），因此交換緩衝液可能導致蛋白質沉澱。此外，如果 pH 值的改變使蛋白質超出其活性範圍，蛋白質的活性也可能會消失。

以下各節中的方案描述了使用不同格式的預包柱進行脫鹽和緩衝液交換。

HiTrap^® 脫鹽柱

圖 5.7. HiTrap® 脫鹽柱可使用注射器、泵或層析系統進行簡單有效的基團分離。

HiTrap^® Desalting是一種5 mL色譜柱（圖5.7），填料為SEC培養基Sephadex G-25 Superfine，其基礎為交聯葡聚糖珠。球狀蛋白質的分離範圍介於 M_r 1000 和 5000 之間，排除極限約為 M_r 5000。這可確保分子量大於 M_r 1000 的分子與分子量大於 Mr 5000 的蛋白質/肽進行組別分離。

HiTrap^® Desalting 可用於 pH 值範圍為 2 到 13 的水溶液。預先包裝的培養基在所有常用緩衝液、尿素 (8 M)、胍鹽酸 (6 M) 溶液以及所有非離子和離子洗滌劑中都很穩定。低級醇 (甲醇、乙醇、丙醇) 可以用在緩衝液或樣品中，但我們建議濃度保持在 25% v/v 以下。應避免長時間（數小時）暴露於 pH 值低於 2 或高於 13 的環境中，或暴露於氧化劑中。

當需要完全去除低分子量成分時，建議的樣品容量範圍為 0.1 至 1.5 mL。分離不受流速影響，流速範圍為 1 至 10 mL/min。建議的最大流速為 15 mL/min。使用注射器、泵或色譜系統即可輕鬆進行分離。最多可串聯三根色譜柱，允許處理更大的樣品量。為避免交叉污染，請僅使用相同類型的樣品進行色譜柱分離。

使用注射器進行手動純化

。

圖 5.8. 用注射器使用 HiTrap® 色譜柱。(A) 準備緩衝液和樣品。取下色谱柱的顶盖并拧下末端。(B) 平衡色譜柱，載入樣品，並開始收集馏分。(C) 洗滌並洗出，繼續收集馏分。

1. 在注射器中注入結合緩衝液。取下瓶塞，將色谱柱與注射器（使用隨附的接頭）「滴對滴 」連接，以避免將空氣引入色譜柱。
2. 移除色谱柱出口的卡扣端
3. 用 5 柱体积的结合缓冲液平衡色谱柱。
4. 使用与色谱柱上的 Luer 连接器连接的注射器涂抹预处理过的样品。
5. 使用 5 至 10 柱容量的結合緩衝液進行清洗，直至液體中無物為止。保持 1 至 2 mL/min 的流速（1 mL 柱）和 5 至 10 mL/min 的流速（5 mL 柱）進行清洗。可選：收集流出液（1 mL 色譜柱收集 1 mL 分離液，5 mL 色譜柱收集 2 mL 分離液），保留至程序成功完成。保留一份樣品用於 SDS-PAGE 分析，以測量蛋白質與介質結合的效率。
6. 用 5 至 10 柱容量的洗滌緩衝液進行洗滌。保持 0.2 至 1 mL/min（1 mL 色谱柱）和 0.5 至 5 mL/min（5 mL 色谱柱）的流速进行洗脱。
7. 洗脱后，用 3 至 5 柱体积的结合缓冲液洗涤色谱柱，使其再生。現在，色譜柱已準備好進行新的純化。

* 使用注射器注射 HiTrap^® 1 mL 色谱柱时，1 mL/min 大约相当于 30 滴/分钟；使用 HiTrap^® 5 mL 色谱柱时，5 mL/min 大约相当于 120 滴/分钟。

對於大容量的樣品，可以使用蠕動泵來施加樣品和緩衝液。

材料

抱歉，發生意外錯誤。

Network error: Failed to fetch