尺寸排阻色譜法的樣品製備

用於色層淨化的樣品應是清晰且不含顆粒物質的。

樣品提取程序以及緩衝液、添加劑和洗滌劑的選擇主要取決於材料的來源、目標分子的穩定性、將採用的層析技術以及產品的預期用途。這些主題在《蛋白質純化手冊》中有概括性的論述，而在《重組蛋白質手冊》和《抗體純化手冊》中則根據目標分子有更明確的論述。

樣品澄清

離心和過濾是標準的實驗室樣品澄清技術，在處理小樣品時經常使用。

强烈建议在色谱纯化前立即离心和过滤任何样品。

離心

離心可去除脂質和微粒物質，例如細胞碎片。如果離心後的樣品仍不清晰，可使用濾紙或 5 μm 過濾器作為第一步過濾器，再使用下列其中一種過濾器作為第二步過濾器。

• 對於小量樣品或會吸附在過濾器上的蛋白質，以 10 000 × g 離心 15 分鐘。
• 對於細胞裂解液，以 40 000 至 50 000 × g 離心 30 分鐘。
• 離心後可用玻璃棉過濾血清樣品，以除去殘留的脂質。

過濾

過濾可去除微粒物質。

對於層析前的樣品準備，請選擇與層析介質珠子大小相關的過濾器孔徑（表 A3.1）。

表 A3.1 過濾器孔徑建議

過濾器的標稱孔徑	層析介質的粒徑
1 μm	90μm以上
0.45 μm	34 μm
0.22 μm	3、10、15 μm 或需要額外乾淨的樣品或無菌過濾時

在試運行中檢查目標蛋白質的回收率。有些蛋白會非特異性地吸附在過濾器表面。

脫鹽

變性

表 A3.2 常見的變性劑

變性劑	典型使用條件	去除/註釋
尿素	2~6M
胍盐酸盐3至6 M	使用Sephadex G-25去除

詳細資料取自：Scopes R.K.、Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998) 及其他資料來源。

沉澱和解析

如果已知粗樣品含有污染物，如脂質、脂蛋白或酚紅等會堆積在色譜柱上的污染物，則可能需要特定的樣品製備步驟。

在實驗室規模中，分離沉澱偶爾會用來去除雜質，但在親和標籤蛋白的純化中一般不需要。

在某些情况下，沉淀可以作为蛋白质浓缩和纯化的组合步骤。

沉淀技术通过不同溶解度的原理分离馏分。例如，由於蛋白質物種的疏水程度不同，鹽濃度的增加會增強蛋白質之間的疏水作用，造成沉澱。如圖 A3.1.

所示，分離沉澱可以用三種不同的方式去除粗雜質。

圖 A3.1. 使用沉澱的三種方法。

沉澱技術會受到溫度、pH 值和樣品濃度的影響。

這些參數必須加以控制，以確保結果的可重複性。
大多數沉澱技術不適合大規模製備。

表 A3.3 沉澱技術範例

沉澱劑	典型使用條件	說明
硫酸銨	如下所述。	>1毫克/毫升蛋白質，尤其是免疫球蛋白。	穩定蛋白質，不變性；上清液可直接進入HIC。有助於降低脂質含量。
Dextran sulfate	加入 0.04 mL 10%硫酸葡聚糖和 1 mL 1 M CaCl2，混和 15 min，10 000 × g 離心，棄去沉澱物、	沉澱脂蛋白。
聚乙烯吡咯烷	加入 3% (w/v)，攪拌 4 小時，以 17 000 × g 離心，丟棄沉澱物。	含高水平脂蛋白的樣本，例如：腹水、	硫酸葡聚糖的替代品。
聚乙二醇 (PEG, Mr > 4000)	最高 20% (w/v)。	血漿蛋白質。	不變性，上清液直接進入 IEX 或 AC，難以完全去除。穩定蛋白質。
丙酮 (冷)	在 0 °C 下高達 80% (v/v)。	在微離心機中全速離心後收集沉澱物。
聚乙烯亚胺	0.1%（w/v）。		沉淀聚集的核蛋白。
硫酸丙胺	1%（w/v）.		沉澱聚集的核蛋白。
硫酸鏈黴素	1%（w/v）.		沉澱核酸。
辛酸	(X/15) g，其中 X = 樣品體積。	抗體濃度應為 > 1 mg/mL。	沉澱血清或腹水中的大部分蛋白質，使免疫球蛋白留在溶液中。

詳細資料取自：Scopes R.K.、Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998).

硫酸銨沉澱

硫酸銨沉澱常用於初始樣品濃縮和淨化。隨著鹽濃度的增加，蛋白質會開始 「出鹽」。不同的蛋白質在不同的濃度下會出鹽，我們可以利用這個過程來去除粗提物中的污染蛋白質。鹽濃度需要最佳化，以去除雜質而非所需蛋白質。然後，再增加鹽濃度的步驟應可沉澱目標蛋白質。如果目標蛋白質無法安全地沉澱和再溶解，則只應採用第一步。HIC 通常是極佳的下一個純化步驟，因為樣品已含有高濃度的鹽，可直接應用於 HIC 色譜柱，幾乎不需要額外的準備。升高的鹽濃度可增強樣品中疏水成分與層析介質之間的相互作用。

沉澱所需溶液：

• 飽和硫酸銨溶液（將 100 g 硫酸銨加入 100 mL 蒸餾水中，攪拌溶解）。
• 1 M Tris-HCl，pH 8.0.
• 用於第一純化步驟的緩衝液。

某些蛋白質會被硫酸銨破壞。添加結晶硫酸銨時要小心：局部濃度過高會導致沉澱物被不需要的蛋白質污染。

對於常規、可重複的純化，應避免使用硫酸銨沉澱，而改用層析法。

一般而言，蛋白濃度低於 1 mg/mL 時，沉澱很少有效。

1. 過濾器（0.45 μm）或离心样品（10 000 × g，4 °C）。
2. 在10份样品体积中加入1份1 M Tris-HCl，pH 8.0，以保持pH值。
3. 轻轻搅拌。逐滴加入硫酸銨溶液。添加至 50% 飽和度*。攪拌 1 小時。
4. 以 10 000 × g 離心 20 分鐘。
5. 除去上清液。用相同濃度的硫酸銨溶液（即不會重新溶解沉澱蛋白或導致進一步沉澱的溶液）重懸洗滌沉澱物兩次。
6. 再次離心。
7. 將沉澱物溶解在下一步使用的小容量緩衝液中。
8. 使用脫鹽柱（見第 5 章）用 Sephadex G-25 進行澄清/緩衝液交換步驟時，去除硫酸銨。

*可調整飽和百分比，以沉澱目標分子或沉澱雜質。

達到特定飽和程度所需的硫酸銨量會因溫度而異。 表 A3.4 顯示 20 °C 時所需的硫酸銨量。

表 A3.4 在 20 °C 達到指定飽和度所需的硫酸銨數量

Final percent saturation to be obtained+A1：R23
	20	25	30	35	40	45	5050	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100
Starting percent	在 20 °C 時，每公升溶液中需加入的硫酸銨量 (公克)
0	113	144<	176	208	242	277	314	351	390	430	472	516	561	608	657	708	761
5	85	146	179	212	246	282	319	358	397	439	481	526	572	621	671	723
10	57	86	117	149	182	216	251	287	325	364	405	447	491	537	584	634	685
15	28	58	88	119	151	185	219	255	293	331	371	413	456	501	548	596	647
20	0	29	59	89	121	154	188	223	260	298	337	378	421	465	511	559	609<
25		0	29	60	91	123	157	191	228	265	304	344	386	429	475	522	571
30			0	30	61	92	125	160	195	232	270	309	351	393	438	485	533
35<					0	30	62	94	128	163	199	236	275	316	358	316	358	402	447	495
40		<		0	31	63	96	130	166	202	241	281	322	365	410	457
45						0	31	64	98	132	169	206	245	286	329	373	419
50							0	32	65	99	135	172	210	250	292	335	381
55<									0	33	66	101	138	175	215	256	298	343
60									0	33	67	103	140	179	219	261<	305
65						<					0	34	69	105	143	183	224	267
70												0	34	70	107	146	186	228
75	<				<								0	35	72	110	149	190
80								<						0	36	73	112	152
85				<											0	37	75	114
90																	0	37	76
95																<	0	38

脂蛋白的去除

脂蛋白和其他脂质物质会迅速堵塞色谱柱，建议在开始纯化前将其去除。建議使用沉澱劑，如硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷（在分離沉澱中描述），從腹水等樣本中去除高含量的脂蛋白。

將樣本離心，以避免目標分子與過濾器非特異性結合的風險。

血清等樣本可用玻璃棉過濾，以去除剩餘的脂質。