使用基於 Poly (His) 融合蛋白的 Cytiva 產品進行分離

(His)₆ 標籤是最常用的標籤之一，用於促進重組蛋白的純化和檢測。可提供一系列用於簡單、一步法純化 (His)₆ 融合蛋白的產品 (請參閱純化選項)。聚組氨酸標籤如 (His)₄ or (His)₁₀ are also used.這些標籤可能是 (His)6 的有用替代品，可改善純化結果。例如，由於(His)₁₀ 會更強地結合到抗原介質上，因此在洗脫之前的洗滌步驟中，可以使用較高濃度的洗滌液（咪唑）。這有助於去除可能與 (His)₆  融合蛋白結合的雜質。

螯合 Sepharose 在帶有 Ni²⁺ 離子時，如果蛋白質表面暴露出形成複合物的氨基酸殘基（特別是組氨酸），則會選擇性地結合蛋白質。(His)₆ 融合蛋白可輕易結合，然後用含咪唑的緩衝液洗脫。

His標記蛋白的製備和檢測，以及如何處理以包涵體形式表達的融合蛋白的資訊，在 重組蛋白手冊中有深入的論述：蛋白質擴增和簡易純化，可向 Cytiva 購買。

淨化選項

	結合能力	最大操作流量	備註
100 µg/column	n.a.	即開即用、預先包裝的色譜柱、緩衝液和化學品。與 MicroPlex 24 Vacuum 搭配使用時，具有高通量（最多可同時處理 48 個樣品）。
HisTrap® Kit	12 mg*/色柱	如上，但包括使用注射器進行多達12次純化的緩衝液。
12毫克*/柱	4毫升/分	預先包裝的色譜柱，可直接使用。
60毫克*/柱	20毫升/分	預先包裝的色譜柱，可立即使用。
快速流速12 mg*/mL 介质	400 cm/h**	以悬浮液形式供应，用于填料柱和放大。

* 估計為 (His)₆ M_r 27 600 的融合蛋白，結合能力因特定蛋白而異。

** 請參閱 附錄 4 將線性流量 (cm/h) 轉換為容積流量。最大工作流量是在床高 10 cm、內孔距 5 cm 的填料柱中測量計算出來的。

純化示例

圖 25 和 26 展示了以可溶性形式或包涵體形式表達的重組蛋白的純化，圖 27 給出了以包涵體形式表達的重組蛋白同時進行柱上純化和重折叠的示例。

圖 25. 在 HiTrap^® Chelating HP（5 mL，充有 Zn2+）上純化重組蛋白質。

圖 26. 在 HiTrap^® Chelating HP（1 mL，充有 Ni2+）上從包涵體中純化(His)10-標記蛋白質。

圖 27. 在 HiTrap^® Chelating HP（1 mL，充有 Ni2+）上一步重折叠和纯化 (His)6 标记的重组蛋白。樣品與色譜柱結合，所有未結合的物質被洗淨。從洗滌緩衝液開始，以 6-0 M 尿素線性梯度進行結合蛋白的再折疊，最後以再折疊緩衝液結束。可使用 30 mL 或更大的漸變量和 0.1-1 mL/min 的流速。每種蛋白質的最佳重折疊速率應通過實驗確定。使用 10-20 mL 線性梯度洗離重折疊的重組蛋白，以重折疊緩衝液開始，以洗離緩衝液結束。

進行分離

圖28顯示了使用預包裝HiTrap^®螯合HP色譜柱進行多聚(His)融合蛋白純化的簡易性。所述方案已針對 (His)₆ 融合蛋白的高產率純化進行了優化，可作為擴大規模的基礎。HisTrap^®試劑盒提供了另一種優化方案，可達到高純度。

圖 28. HiTrap^® Chelating HP 和 poly (His) 融合蛋白純化的示意圖概述。

鎳溶液： 0.1 M NiSO₄

結合緩衝液： 20 mM 磷酸鈉、0.5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4

洗脱缓冲液：20 mM 磷酸钠，0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4

1. 用 5 柱容量的蒸餾水洗柱。
   使用水，而不是緩衝液，洗去含有 20% 乙醇的柱儲存液。這樣可避免下一步中鎳鹽沉澱的風險。
2. 將 0.5 柱容量的 0.1 M 鎳溶液加到色譜柱上。
3. 用 5 個柱容量的蒸餾水洗滌。
4. 用 10 個柱容量的結合緩衝液平衡色譜柱。
5. 以 1-4 mL/min (1 mL 色譜柱) 或 5 mL/min (5 mL 色譜柱) 的流速進樣。收集流過的部分。泵更適合應用於超過 15 mL 的樣品量。
6. 用 10 柱容量的結合緩衝液清洗。收集洗滌馏分。
7. 使用 5 柱容量的洗滌緩衝液進行洗滌。以 1 mL 等小分量收集洗出馏分，以避免洗脱液被稀释。
8. 用 10 柱体积的结合缓冲液清洗。如果要純化相同的 (His)₆ 融合蛋白，則很少需要重新添加金屬。

咪唑在 280 nm 處吸收。監測吸光度時，使用洗滌緩衝液作為空白。

如果需要去除咪唑，請使用脫鹽柱（見第 133 頁， 用于亲和层析的缓冲液交换和脱盐）。

對於少量產品的單次純化或高通量篩選，His MicroSpin 色譜柱可與離心或 MicroPlex 24 真空配合使用，既方便又簡單。

若要增加產量，請串聯使用多支 HiTrap^® Chelating HP 色譜柱 (1 mL 或 5 mL)。HiTrap^® 螯合 HP 色谱柱（1 mL 或 5 mL）可与注射器、蠕动泵或色谱系统配合使用。如需更大的容量，可將螯合 Sepharose^® Fast Flow 裝入合適的色譜柱（見附錄 3, 色譜柱的製備）。

在較低的 pH 值下，金屬離子的流失更為明顯。如果要純化相同的蛋白質，則每次純化之間不需要剝離色譜柱（即去除所有金屬離子）。

純化柱的重複使用取決於樣品的性質，只有在處理相同樣品時才考慮重複使用，以避免交叉污染。

使用 HisTrap^® Kit 進行純化

HisTrap^® Kit 包括使用注射器進行 12 次純化所需的一切。三支即用型HiTrap^®螯合HP 1 mL柱和現成的濃縮緩衝液隨附簡易說明。

Cleaning

重新充電或儲存前去除鎳離子：

1. 用 5 柱容量的 20 mM 磷酸钠、0.5 M NaCl, 0.05 M EDTA, pH 7.4。
2. 用 10 柱容量的蒸餾水洗滌。
3. 儲存時，用 5 柱容量的 20% 乙醇洗滌。

去除沉澱的蛋白質：

1. 向柱中注入 1 M NaOH，培養 2 小時。
2. 用 5 柱容量的水和 pH 7.0 的緩衝液洗去溶解的蛋白質，直到流出液的 pH 達到 7.0。

媒體特性

	成分	金屬離子容量	pH穩定度*	平均粒徑
Chelating Sepharose High Performance (HiTrap® Chelating HP)	Iminodiacetic acid  透過醚鍵與 Sepharose® High Performance 結合。	23 µmoles Cu2+/mL	Short term 2-14 Long term 3-13	34 µm
二醋酸  使用環氧樹脂(epoxy)螯合，透過spacer  arm 耦合 Sepharose® Fast Flow。	22-30 µmoles Zn2+/mL	短期 2-14 長期 3-13

化學穩定性

在所有常用的水性緩衝液和變性劑（如 6 M 氫鹽酸胍和 8 M 尿素）中都很穩定。

儲存

在中性pH值下，用20%乙醇清洗介質和色譜柱（填料介質使用約5個色譜柱容量），並儲存於+4至+8 °C。

長期儲存後，色譜柱必須重新充入金屬離子，以重新激活介質。