親和層析的緩衝液交換和脫鹽

文獻中經常提到透析是一種去除鹽分或其他小分子並交換樣品緩衝成分的技術。然而，透析通常是一種非常緩慢的技術，需要大量的緩衝液。在處理過程中，或由於蛋白質分解或與透析膜的非特殊結合，有可能造成物質流失。更簡單快速的技術是使用含有 Sephadex G-25 的脫鹽柱，在高分子量和低分子量物質之間進行組別分離。

在一個快速的單步驟中，樣品被脫鹽，轉移到新的緩衝液中，低分子量物質被移除。

脫鹽柱不僅可用於去除低分子量污染物（如鹽），還可用於不同色譜步驟前後的緩衝液交換，以及快速去除試劑以終止反應。

可處理高達脫鹽柱總容量 30% 的樣品。使用普通水性緩衝液時，只要蛋白質濃度不超過 70 mg/mL，樣品濃度不會影響分離效果。樣品應完全溶解。

對於小量樣品，可以使用用於層析純化的緩衝液稀釋樣品，但仍需去除細胞碎片和微粒物質。

為了防止可能發生的離子相互作用，建議在脫鹽過程中和最終的樣品緩衝液中使用低鹽濃度（25 mM NaCl）。

如果需要避免 NaCl 的存在，可以使用 100 mM 乙酸銨或 100 mM 碳酸氫銨等揮發性緩衝液。

圖 76 顯示了典型的緩衝液交換和脫鹽分離。可根據 UV 吸收和電導率的變化來監測該過程。

圖 76. 小鼠血漿 (10 mL) 在 HiPrep™ 26/10 除鹽器上進行緩衝液交換。

對於實驗室規模的操作，表 16顯示了預包裝、即用型脫析和緩衝物交換色譜柱的選擇指南。

表 16 脫鹽和緩衝交換的選擇指南。

MicroSpin G-25	0.1-0.15 mL	0.1-0.15 mL
1.5-2.5 mL	2.5-3.5 mL
HiTrap Desalting 5 mL	0.25-1.5 mL	1.0-2.0 mL
2.5-15 mL	7.5-20 mL

要脫鹽更大的樣品容量：

• 最多串聯 5 HiTrap^® 5 mL 脫鹽柱以增加樣品容量，例如 2 柱：樣品容量 3 mL，5 柱：樣品容量 7.5 mL。
• 最多可串聯 4 支 HiPrep^™ 26/10 脫盐柱以增加樣品容量，例如 2 支柱：樣品容量 30 mL，4 支柱：樣品容量 60 mL。即使串聯 4 支色谱柱，在室溫下，在水性緩衝液中，樣品也可在 20 至 30 分鐘內完成處理。每個樣品的脫鹽和緩衝液交換時間少於 5 分鐘，大部分蛋白質的回收率高於 95%。

  替代方案 1：使用注射器用 HiTrap^®手动脱盐 5 mL

  1. 在注射器中注入缓冲液。移除止塞。為避免將空氣引入色譜柱，將色譜柱 「滴對滴 」連接至注射器（通過提供的轉接器）。
  2. 取下扭結端。
  3. 以 5 mL/min 的速度用 25 mL 緩衝液沖洗色譜柱，以完全去除 20% 乙醇（作為儲存緩衝液提供）。如果柱中殘留空氣，請使用脫氣緩衝液清洗，直到空氣消失。
  4. 使用 2-5 mL 注射器，以 1-10 mL/min 的流速上樣。
  5. 如果樣品量少於 1.5 mL，則換用緩衝液繼續進樣，直到洗出總量 1.5 mL。
  6. 用從表 16 中選擇的適當容量稀釋蛋白質。

  按所示容量收集脫鹽蛋白質。

  注意：當使用 HiTrap^® 5 mL色譜柱時，5 mL/min約相當於120滴/min。也可以使用簡單的蠕動泵來施加樣品和緩衝液。

  建議的最大樣品容量為 1.5 mL。請參閱表 17，瞭解減少施加到色谱柱上的樣品容量的效果。

  建議的最大樣品容量為 1.5 mL。

表 17 建議使用注射器或 Multipipette™ 的樣品和洗脫容量。

產量百分比0.25	1.25	1.0	> 95	0.0	4.0
0.50	1.0	1.5	> 95	< 0.1	3.0
1.00	0.5	2.0	> 95	< 0.2	2.0
1.50	0	2.0	> 95	< 0.2	1.3

也可以使用簡單的蠕動泵來施加樣品和緩衝液。
替代方案 2：使用ÄKTAprime plus進行簡單的脫鈣處理

ÄKTAprime plus包含預先編程的模板，適用於個別 HiTrap^® 5 mL脫鈣柱和 HiPrep^™ 26/10脫鈣柱。

Buffer Preparation

準備至少500 mL所需的緩衝液。

1. 按照ÄKTAprime plus提示卡上提供的說明，連接色譜柱並使用緩衝液加載系統。
2. 選擇應用模板。
3. 啟動方法。
4. 輸入樣品容量，按OK。

圖77顯示了ÄKTAprime plus得到的典型結果。紫外線（蛋白質）和電導率（鹽分）痕跡可將脫鹽馏分匯集起來。

圖 77. (His)6 融合蛋白在 ÄKTAprime plus 上的脫鹽。