使用單株抗體親和膠對 FLAG 融合蛋白進行免疫沉淀

• 什麼是 FLAG 多肽標籤，它如何用於分離和純化蛋白質？
• 免疫沉澱技術概述
• 使用 M2 親和膠對 FLAG 融合蛋白進行免疫沉澱 (IP) 的步驟
• 少量 FLAG 融合蛋白的純化

免疫沉澱 (IP) 可用於高效率、高產量地分離和純化融合了 FLAG^® 多肽標籤的蛋白質。IP 使用 ANTI-FLAG^® M2 親和膠進行，這是一種共價結合在瓊脂糖樹脂上的高度特異性單株抗體。親和樹脂允許 FLAG^® 標記蛋白的有效結合，而不需要初步的步驟和校準。免疫沉淀的 FLAG^® 标记融合蛋白可在酸性条件下或通过与 FLAG^® 肽竞争从树脂中有效洗脱。免疫沉淀的蛋白可以在电泳过程中分析其大小、翻译后修饰和凝胶相互作用，也可以通过活性测定进行分析。

免疫沉淀的蛋白可以在电泳过程中分析其大小、翻译后修饰和凝胶相互作用，也可以通过活性测定进行分析。

什麼是 FLAG 多肽標籤，它如何用於分離和純化蛋白質？

FLAG^®肽是用於蛋白質檢測和純化的標記肽。FLAG^®標記肽由8個氨基酸（DYKDDDDK）組成，最大限度地提高了免疫原性，因此針對FLAG^® 序列的高親和性單克隆抗體，可用於檢測和分離含有 FLAG^® 多肽的蛋白質。利用重組技術，可在蛋白質的 N 端、C 端、或 N 端前的蛋氨酸殘基（Met-FLAG^®），以及內部位置加入 FLAG^®標記肽

免疫沉淀技術概述

免疫沉淀包括以下步驟和中間體：細胞裂解、特定抗原與抗體結合、抗原-抗體複合物、沉澱、沉澱液洗淨、抗原與免疫複合物解離。

使用 M2 親和凝膠對 FLAG 融合蛋白進行免疫共沉淀 (IP) 的步驟。/h2>

使用 EZ view red antiFLAG M2 親和凝膠 A2220。

少量 FLAG 融合蛋白的純化

注意： 免疫沉淀过程中建议使用两个对照反应

• 阳性对照（FLAG-BAP融合蛋白，如氨基末端的 P7457 或Met-FLAG-BAP融合蛋白 P5975)
• 陰性對照（不含蛋白質的空白試劑）

a) 仔細混合親和膠珠至完全懸浮。使用寬口移液管吸頭，或在普通移液管吸頭末端切去 1 mm，立即等分 40 µL 的 50% 漿液（20 µL 的填充凝膠體積）到 1.5 mL 微離心管中。

b) 清洗/平衡珠子：加入 500 µL TBS (50 mM Tris HCL, 150 mM NaCl, pH 7.4)，渦旋並以 5000-8,200 x g 離心 30 - 60 秒。

c) 清洗 再次如上，將試管置於冰上，直到準備加入樣品。  注意：同時處理多個免疫沉澱樣品時，可將所需的 合併 樹脂量一起清洗。每次洗滌應使用 TBS，其容積至少為包裝凝膠總容積的 20 倍。洗淨後的樹脂可以等分，用於所需數量的樣品。

d) 樣本製備：

• 離心（14,000 x g，10-15 分鐘，2-4°C）
• 計算所需的裂解液量。用量取決於轉染細胞中 FLAG 融合蛋白的表達水平。

e) 結合：加入 200-1000 µL 的細胞裂解液（如有必要，加入裂解緩衝液 [50 mM Tris HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100]，使最終容量達到 1 mL）。注意：裂解液的量取決於轉染細胞中 FLAG 融合蛋白的表達水平。對於陽性對照，加入 1 mL TBS 和 4 µL 50 ng/µL 的 FLAG-BAP 融合蛋白（約 200 ng）。對於陰性對照，僅加入 1 mL 裂解緩衝液。 孵育 所有樣品和對照在 2-8°C 下使用滾動搖床或端端搖床搖動約 1-2 小時（結合步驟可延長過夜以確保最大結合）。

f) 以 5000-8,200 x g 離心 30 秒-1 分鐘，吸出上清液（流透液）。

g) 清洗珠子：加入 500 µL TBS，渦旋並在 5000-8,200 x g 下離心 30 秒-1 分鐘，去除上清液

h) 再重複洗滌兩次.

i) Elution of the sample：

1. FLAG融合蛋白的洗脱可在原生條件下通過使用3X FLAG肽（F4799）的競爭來實現。這種洗脫方法是最有效的方法。
2. 可以在酸性條件下使用 0.1 M glycine HCl, pH 3.5 進行洗脫。這種洗脫方法快速有效，但需要立即中和樣品。
3. 可以使用 SDS-PAGE 樣品緩衝液進行電泳洗脫。

用 3X FLAG 多肽 (F4799)

i.製備 3X FLAG 多肽：

• 將 3X FLAG 多肽溶於 0.5 M Tris HCL, pH 7.5 1 M NaCl中溶解，最终浓度为25 µg/µL
• 用diH₂0将储备液稀释5倍，最终浓度为5 µg/µL
• 在 100 µL TBS 中加入 3 µL 5 µg/µL 原液，配制 150 ng/µL 的洗脱工作液。

ii.在每個樣品中加入 100 μL 3X FLAG 洗脱工作溶液，在 2-8°C下溫和振動孵育 30 分鐘。

iii.以 5000-8,200 x g 離心 30 秒-1 分鐘，將上清液轉移到新的試管中。注意不要轉移任何樹脂。

1. Elution under acidic conditions (0.1 M glycine HCl pH -3.5) Procedure performed at room temperature.

i.每個樣品加入 100 µL 0.1 M glycine HCl，pH 3.5
ii.輕輕搖動孵育 5-10 分鐘
iii.將樹脂以 5000-8200 x g 離心 30 秒-1 分鐘
iv.將上清液轉移到含有 10 µL 0.5 M Tris HCl（pH 7.4）和 1.5 M NaCl 的新試管中和樣品
v. 立即使用或儲存於-20°C。

2. Elution with SDS-PAGE sample buffer (62.5mM Tris HCl, pH 6.8 with 2% SDS, 10% (v/v) glycerol and 0.002% bromophenol blue. 程序在室溫下進行。

注意：為了減少抗體的變性，不應加入還原劑（DTT 或 2-巯基乙醇）。加入還原劑會使固定化 M2 抗體的重鏈和輕鏈解離（25-50kDa 帶）

i.每個樣品加入 20 µL 2X 樣品緩衝液
ii.煮沸樣品 3 分鐘
iii.以 5000-8200 x g 離心 30 秒 - 1 分鐘
iv.將上清液轉移到新的試管中。樣品可上載至 SDS-PAGE。

圖 1. 在批次模式下用於低豐度蛋白質免疫沉淀的選項摘要

材料

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