RNA 免疫沉澱 qPCR (RIP- qPCR) 協定

RNA免疫沉淀（RIP）-qPCR

使用 Magna RIP™ RNA結合蛋白免疫沉淀試劑盒（產品編號 17-700）分離出的RNA可以用幾種分子方法進行分析，包括端點RT-PCR和定量RT-PCR（如果已知RBP的結合靶點），或者微陣列或深度測序方法。鑑於已知序列的 RNA 目標，可以設計基因特異性引物，以驗證（和量化）所使用抗體免疫共沉淀的 RNA。一旦可以確認成功的 RIP，就可以使用基於族群的方法，例如結果 cDNA 的比較微陣列雜交，或 RIP 反應的分子適應產物的深度測序，來進一步檢驗免疫沉淀中的 RNA 族群（見 Baroni, T.E. et al、Methods Mol Biol. 419:93-108）。

下面介绍的是使用 EZ-Magna RIP™ 试剂盒中提供的对照抗体（产品编号.17-701），Anti-SNRNP70。

对于反转录，请使用任何市售的使用随机六聚体作为引物的反转录酶和试剂盒系统。由於與 U1 剪接體 SNRNP70 蛋白共沉澱的成熟 U1 snRNA 沒有多腺苷酸化，因此不建議使用 oligo d(T) 引物。

注意： 建議在本節中使用不含 RNase 的抗噴霧吸頭，以減少污染風險。

1. 標示適當數量的 0.2 mL PCR試管，並放置在冰上。
2. 加入9 μL（最多2 μg RNA）適當的樣本到PCR試管中，並放回冰上。
3. 如下表所示，在冰上向每個PCR反應管中加入適量的試劑。

試劑	1個反應的容量(μL)
RNA	9.0
2X RT Buffer	10.0
20X 酵素混合液	1.0
每個反應總計	20。0

4. 將 PCR 反應管置於熱循環器中。
5. 啟動下列 RT 反應程式：
   

RT反應	37°C	60分鐘
停止反應	95 °C	5分鐘
保溫	保持

6. 移除 PCR 管。 用 180 μL 無核酸水稀釋反應（10X 稀釋）。反應可儲存於 -20 °C。

標準端點 RT-PCR

1. 根據要分析的樣本數量標記適當數量的 0.2 mL PCR 管，並放置於冰上。
   • 使用本試劑盒中的 RIP 引物進行 PCR 分析至少需要 4 個樣品：來自陽性和陰性對照抗免疫沉淀的 cDNA、輸入物和一個無模板試管，作為 DNA 污染的對照。建議使用者針對其他物種的 cDNA 設計適當的特異引物，並根據經驗決定 PCR 反應條件。
2. 在 PCR 管中加入 2 μL 適當的樣品，並放回冰中。
3. 在冰上向每支PCR反應管中加入適量試劑，先加入H2O，最後再加入Taq聚合酶。
   • 為獲得最佳效果，請使用Hot-Start Taq 聚合酶。如果您不使用 Hot-Start Taq 聚合酶，則必須在初始變性步驟後向每個試管中加入 Taq 。
   • 如果需要母體反應混合物，請分配足夠的試劑，以便多用一個試管，以計算體積損失。
4. 將 PCR 反應管置於熱循環器中。
5. 啟動下列 PCR 反應程式。
6. 取出每個 PCR 反應的 10 μL 用 2% 琼脂糖凝膠電泳與 100 bp DNA 標記進行分析。對於 EZ-Magna RIP™ RNA 結合蛋白免疫共沉淀試劑盒（產品編號 17-701）中包含的 U1 snRNA，PCR 产物的預期大小為 100 碱基對。 

即時定量 PCR

1. 加入 2 μL cDNA 樣品到適合您選擇的即時儀器的 PCR 試板中（建議對每個 RIP 樣品進行一式三份的 qPCR 反應）。
2. 製備主反應混合物。 分配足夠的試劑給一個額外的試管，以計算體積損失。
3. 向 2 μL 样品中加入 23 μL qPCR 混合液。
4. 使用瓶盖或光学胶带密封平板并开始 qPCR 反应。

有關 RIP 實驗指南、故障排除技巧和補充方案的更多資訊，請查看我們的 RNA Immunoprecipitation (RIP) 頁.

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