cOmplete™ His-Tag 純化柱規範與疑難排解

 

純化規範

完整的 His-Tag 純化柱（產品編號. COHISC-RO）與ÄKTAexplorer等自動化色譜系統相容。

在原生條件下純化

原生蛋白質的純化應使用目標蛋白質的最佳緩衝條件。
警告: 如果緩衝液組成不理想，結合能力可能會顯著下降。
注意： 為達到最佳效果，請以低流率載入，使目標蛋白更有效地與樹脂結合。
警告： cOmplete His-Tag Purification Columns 已使用下表中指定的 Buffer A 和 Buffer B 進行了最佳化。
缓冲液A： 50 mM NaH₂PO₄，pH 8.0; 300 mM NaCl
緩衝液 B: 50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM imidazole
注意： 以下方案描述了使用ÄKTAexplorer 100 System (Cytiva) 進行 FPLC 純化時的實驗程序。

1. 使用10至20 mL 缓冲液A 使用  清洗泵。系統清洗 功能，流速 10 mL/min。
2. 取下柱出口的塞子，將其連接到ÄKTAexplorer系統的出口管上。 注意： 保存色谱柱出口的插頭，以防色譜柱需要儲存或計劃重複使用。
3. 一旦 缓冲液A 从ÄKTAexplorer系统的入口管中流出，从色谱柱上取下上塞，并立即将其连接到ÄKTAexplorer系统的入口管上。在ÄKTAexplorer系統上持續測量外徑₂₈₀ 值。 Note: If a fluorescent protein is purified, continuously measure the OD values at the absorption maximum of the fluorescence dye; e.g.、 GFP（綠色螢光蛋白質）的OD₄₈₅ 或CFP（青色螢光蛋白質）的OD₄₃₅ 。 Note: Save the plug of the column inlet in case in case the column needs to be stored or is planned to be reused.
4. 將流速定為 5 mL色譜柱10 mL/min；或 1 mL色譜柱2 mL/min 並用10個柱容量的 緩衝液A平衡色譜柱。
5. 暫停運行。以5 mL色谱柱2.5 mL/min或1 mL色谱柱0.5-1 mL/min的流速，將已清除的樣品（例如，經過超速離心或過濾步驟）載入色谱柱。 警告： 为防止堵塞色谱柱，请在装柱前清除不溶性物质。 警告： 由于该树脂的结合特异性较高，因此蛋白质粘附到树脂上的动力学速度比其他可用树脂慢。
6. 使用緩衝液 A 清洗柱子，直到 OD₂₈₀ 值達到基線水平（約 10 柱子容量）。
7. 用梯度 缓冲液 A （不含咪唑）和 缓冲液 B （250 mM 咪唑）冲洗 His 标记的蛋白。 Warning: Protein peaks can be expected between 25 to 45 mM imidazole. 由於 cOmplete His-Tag 純化柱的特殊特性，蛋白質已經可以用大約 25 mM 的咪唑洗離。 Warning: The amount of imidazole required in the elution buffer for efficient release of the target protein from the resin depends on various parameters, such as: - the length of the His-tag, - the accessibility of the His-tag.
8. 為下一次運行進行清洗和平衡。有關詳情，請參閱第 清洗步驟節。 警告： 如果色譜柱不立即重複使用，請用2個柱容量的2 M咪唑清洗色譜柱，以去除蛋白質的非特異結合。用 20% 的乙醇溶液平衡色谱柱，并用塞子紧闭色谱柱的两个螺纹。儲存於 +2 至 +8 °C 以防止細胞生長。

注意： 請參閱純化過程最佳化 和故障排除 兩節，以獲得最佳化純化結果的技術建議。

變性條件下的純化

變性蛋白質的純化應使用目標蛋白質的最佳緩衝條件。
cOmplete His-Tag 純化柱可靈活選擇最佳緩衝條件。
警告： 在緩衝溶液中加入尿素會導致pH值下降。
警告： 如果緩衝液成分不理想，結合能力也可能顯著下降。
注意： 為達到最佳效果，請使用低流速加載，以便更有效地將目標蛋白結合到樹脂上。
警告： cOmplete His-Tag Purification Columns have been optimized using Buffer C, ；缓冲液D、 缓冲液E和 缓冲液F 在下表中指定。其他緩衝液可能也有同樣的功能，但在與 cOmplete His-Tag 純化柱一起使用之前需要進行測試。
緩衝液 C： 100 mM NaH₂PO₄; 10 mM Tris-HCl; 8 M 脲; pH 8.0
緩衝液 D： 100 mM NaH₂PO₄; 10 mM Tris-HCl; 8 M 脲; pH 6.3
緩衝液 E： 100 mM NaH₂PO₄; 10 mM Tris-HCl; 8 M 脲; pH 5.9
緩衝液 F： 100 mM NaH₂PO₄; 10 mM Tris-HCl; 8 M 脲; pH 4.5
注意： 以下方案描述了使用 ÄKTAexplorer 100 System (Cytiva) 進行 FPLC 純化時的實驗程序。

1. 使用ÄKTAexplorer系統的 System Wash 功能，以10至20 mL Buffer C 清洗泵，流速為, e.例如，10 mL/min。
2. 取下柱出口的塞子，將其連接到ÄKTAexplorer系統的出口管上。 注意： 保存色谱柱出口的插頭，以備儲存或重複使用。
3. 一旦 缓冲液C 从ÄKTAexplorer系统的进样管中流出，从色谱柱上取下上塞，并立即将其连接到ÄKTAexplorer系统的进样管上。在ÄKTAexplorer系統上持續測量外徑₂₈₀ 值。 Note: If a fluorescent protein is purified, continually measure the OD values at the absorption maximum of the fluorescence dye; e.g.，GFP（綠色螢光蛋白）的OD₄₈₅ 或CFP（青色螢光蛋白）的OD₄₃₅ 。 Note: Save the plug of the column inlet in case in case the column needs to be stored or is to be reused.
4. 將流速設定為 5 mL 色譜柱10 mL/min;或 1 mL 色譜柱2 mL/min 並用10個柱容量的 緩衝液C平衡色譜柱。
5. 暫停運行。將清除的樣品（例如，經過超速離心或過濾步驟）載入色譜柱，5 mL色譜柱的流速為2.5 mL/min，1 mL色譜柱的流速為0.5至1 mL/min。 Warning: To prevent blocking of the column, remove insoluble material before loading the column. 警告： 由于该树脂的结合特异性较高，蛋白质粘附到树脂上的动力学比其他可用树脂慢。
6. 用 缓冲液C 洗柱，直到OD₂₈₀ 值达到基线水平（大约10个柱体积）。
7. 用 10 至 20 柱容量的 缓冲液 D.
8. 用 10 至 20 柱容量的 缓冲液 E.
清洗。
9. 用 10 至 20 支柱容量的緩衝液 F 迴洗 His-tagged 蛋白。 注意： 另外，也可以使用 缓冲液A 和 缓冲液A 梯度至200 mM咪唑溶液进行洗脱。nbsp;緩衝液B 代替pH值轉移選項（參閱第 原生條件下的純化節中的洗滌步驟）。
10. 在變性條件下，用 緩衝液C 清洗和平衡下一次運行；如果色譜柱將在原生條件下使用，則用 緩衝液A 清洗以去除變性劑。有關詳情，請參閱第 清洗步驟節。 警告： 如果色譜柱不立即重新使用，請用2個柱容量的2 M咪唑清洗色譜柱，以去除蛋白質的非特異結合。用 20% 的乙醇溶液平衡色谱柱，并用塞子紧闭色谱柱的两个螺纹。儲存於 +2 至 +8 °C 以防止細胞生長。

注意： 請參閱第 純化過程最佳化 和 疑難排解 節，以獲得最佳化純化結果的技術建議。

清洗步驟

完整的 His-Tag 純化柱可多次使用而不會失去結合能力。然而，隨著時間的推移，一些蛋白質聚集可能會累積，導致柱內樹脂的效率降低。
清洗程序可去除聚集物，進一步提高色譜柱的使用效率。可根據不同的應用進行不同的清洗程序。清洗程序完成後，應將樹脂轉移至 20% 乙醇中。

嚴格的原生清洗

此方法適用於已純化非聚集蛋白，以及再次使用色譜柱來純化相同蛋白質的情況。

• 用10個柱容量的1 M咪唑/HCl，pH 7.5清洗，
• 用10個柱容量的4 M咪唑/HCl，pH 7.5清洗，
• 用結合緩衝液平衡柱子，進行下一輪的純化，或者將材料轉移到20%乙醇中。

使用 SDS 進行變性清洗

此方法適合去除聚集的蛋白質和脂質。
警告： 此清洗程序必須在 +15 至 +25 °C 下執行，因為 SDS 的溶解度在此溫度下比在 +2 至 +8 °C 下更有效。
注意： SDS 緩衝液也可能含有 50 mM DTT。
Warning: Avoid using K⁺ in this buffer to prevent precipitation with SDS.

• Wash with 10 column volumes of 1 M imidazole/HCl, pH 7.5，
• 用10柱体积的1 M咪唑/HCl，pH 7.5，20%乙醇，2到4% SDS洗涤2次，
• 用3次10柱体积的20%乙醇去除SDS。

用 Guanidinium-HCl 進行變性清洗

此方法適合去除聚集蛋白。
注意： 胍基-HCl 緩衝液也可能含有 50 mM DTT。

• 用 10 柱容量的 1 M 咪唑/HCl，pH7.5，
• 用 10 柱容量的 6 M 胍-HCl，1 M 咪唑，pH7.5,
• 用 10 柱容量的 20% 乙醇清洗兩次。

注意： 一般而言，清洗方法的選擇取決於蛋白質類型。
註： 使用胍基-HCl 的變性清洗程序比使用 SDS 的變性清洗方法受到的限制較少。

純化程序最佳化

允許最大蛋白質產量和純度的參數可能會因特定目標蛋白質的特性而有顯著的差異。要優化蛋白質純化程序以獲得最高的蛋白質純度，需要確定特定目標蛋白質的最佳操作條件。蛋白質製備的純度和產率都取決於樣品量。如果樣品量過多，樹脂的結合能力可能不足以結合所有目標蛋白，這將導致蛋白質產率不理想。如果樣本量太少，樹脂上剩餘的結合位點可能會與裂解液成分產生背景結合。當目標蛋白的量與色譜柱內樹脂的量相匹配時，就能獲得最佳的結果。特定目標蛋白的容量取決於幾個因素，如目標蛋白的大小、構象、多聚化狀態、His-標記的長度和可及性、His-標記蛋白的表達水平和可溶性、裂解液濃度以及緩衝液的 pH 值和組成。為達到最佳效果，請確定純化特定相關蛋白所需的裂解液與柱內樹脂體積的最佳比例，此比例取決於蛋白的表達速率：

• 在平行測試實驗中，用不同容量的裂解液培養色譜柱，
• 清洗色譜柱並洗離結合的蛋白質，
• 當只有少量目標蛋白留在流過液中，而在洗出液馏分中檢測到最大蛋白量時，裂解液的容量是最佳的。

註： 目標蛋白質的產率可透過讓蛋白質與樹脂結合更長的時間來優化。
註： 在結合、清洗和洗滌步驟中，咪唑的最佳濃度也可以在預試實驗中確定。
註： 對於與這些條件相容的目標蛋白質，通常可使用 pH 8.0 含有高鹽濃度 (300 mM) 的緩衝液獲得最佳結果。

疑難排解

問題；可能原因；建議

床層樹脂中形成氣泡：

• 儲存緩衝液（20% 乙醇）與水性緩衝液混合； a) 在 +2 至 +8 °C 儲存後，將色谱柱平衡至 +15 至 +25 °C。b) 在平衡色譜柱前對緩衝液進行脫氣。

樣品不容易流過色譜柱（低流速或高背壓）：

•  裂解液中的微粒可能堵塞了色譜柱；a) 將樣品離心或超速離心後再載入色譜柱。

目標蛋白與柱內樹脂的結合效率不高：

• 結合步驟中的緩衝條件不理想；結合步驟中降低咪唑濃度和/或增加pH值。
• 孵育時間太短；a) 延長孵育時間。b) 在結合過程中降低流速。
• 無法接觸到 His-tag； a) 改變 His-tag 的位置。

目标蛋白洗脱不充分或没有洗脱：

• 目标蛋白多聚化，更热衷于与树脂结合；在洗脱过程中增加咪唑浓度。
• 蛋白在洗脱前沉淀在树脂上；a) 增加离子强度以减少等电点沉淀。
• 目標蛋白在 pH 值轉換洗脫過程中沉澱；改用咪唑洗脫。
  

目標蛋白質的回收率太低：

• 目標蛋白質可能被降解；a) 如果在細胞裂解過程中發生降解，在樣品中加入蛋白酶抑制劑。b) 在 +2 至 +8 °C 下工作也可以防止蛋白降解。
  
• His-tag 可能無法被接觸到；a) 使用較長的 His-tag。c) 優化表達條件和緩衝液。 d) 改變 His-tag 的定位。
• His-tag可能已被蛋白酶消化； a) 改用其他表達宿主。 b) 使用蛋白酶抑制劑。
• 目標蛋白可能不溶解； a) 降低表達溫度、強度和誘導時間。b) 在變性條件下進行純化。 c) 加入溶解度增強的融合夥伴。
• 樹脂是有限制的；驗證表達的 His-tagged 蛋白與柱內的樹脂是否成比例。

目標蛋白與污染物一起洗出：

• 宿主蛋白與樹脂相互作用；a) 在上載和洗滌步驟中，通過增加咪唑濃度/降低 pH 值來增加嚴格性。b) 增加樣品量。c) 用嚴格的緩衝液清洗色譜柱。
• DNA和/或RNA污染物；a) 在變性條件下進行純化。b) 將裂解液加入色譜柱前，加入DNase I消化步驟和/或Polymin P介導的沉澱步驟。

目標蛋白在細胞裂解過程中或裂解後被降解：

• 蛋白酶保護不足；a) 在緩衝液和/或培養液中加入蛋白酶抑制劑。
  

目標蛋白在宿主細胞中被降解：

• a)使用蛋白酶缺乏的宿主菌株。b) 縮短誘導時間。

 

材料

抱歉，發生意外錯誤。

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