免疫沉澱程序

疑難排解指南 (PDF)

免疫沉澱 (IP) 是應用最廣泛的免疫化學技術之一。免疫沉澱後進行 SDS-PAGE 和免疫印跡，通常用於各種應用：測定蛋白質抗原的分子量、研究蛋白質/蛋白質的相互作用、測定特定的酶活性、監測蛋白質的轉譯後修飾以及確定蛋白質的存在和數量。

在 IP 方法中，細胞或組織均質物中的蛋白質會在適當的裂解緩衝液中透過免疫複合物沉澱出來，免疫複合物包括抗原（蛋白質）、第一抗體和蛋白質 A-、G- 或 L-瓊脂糖結合物或第二抗體-瓊脂糖結合物。瓊脂糖結合物的選擇取決於第一抗體的種類來源和同種型。所描述的方法具有可比性，方法的選擇取決於特定的抗原-抗體系統。

試劑和設備

1. 琼脂糖結合物：蛋白質A固定於Sepharose^® CL-4B（產品編號 P3391）或蛋白質G-garose 4B（產品編號 P3296）或蛋白質L-garose（產品編號. P3351），或抗體-琼脂糖結合物（二抗結合物根據一抗的種源和同工型）
2. 細胞或組織裂解物製備

Procedure

特定抗原的免疫沉澱
方法 A
SDS-PAGE製備

特定抗原的免疫沉淀

注意： 除非另有說明，否則使用微離心管在冰上進行所有 IP 步驟。

1. 用洗滌緩衝液洗滌琼脂糖結合物兩次，室溫 12,000xg 離心 10 秒。丟棄上清液。
   注意： 如果瓊脂糖結合物是粉末，用去離子 H₂O 重製，並讓其膨脹 5 分鐘。
2. 將瓊脂糖結合物重悬於洗滌緩衝液（50% 懸浮液）中。
3. 根據需要繼續使用方法 A 或方法 B。

方法 A

1. 將瓊脂糖結合物分成 50-100 µL 的等分份（約 25-50 µL 瓊脂糖/50 µL）。
2. 每管加入 10 µL 適當稀釋的一抗（參考抗體規格）。
3. 在室溫下培養 15-60 分鐘，在適當的搖床上輕輕地混和樣品。
4. 在 4 °C 下以 3,000xg 離心 2 分鐘。丟棄上清液。
5. 用 1 mL 洗滌緩衝液清洗每個樣品，在 4 °C下以 3,000xg 離心 2 分鐘。
6. 每管加入 0.1-1.0 mL 细胞裂解液。
7. 在 4 °C 下孵育 90 分钟至过夜，在合适的摇床上轻轻搅拌样品。
8. 在 4 °C、3,000xg 離心 2 分鐘，收集免疫沉淀複合物。丟棄上清液。
9. 用 1 mL 洗滌緩衝液清洗沉澱物，在 4 °C下以 3,000xg 離心 2 分鐘。重複此步驟至少 3 次。

方法 B

1. 在細胞裂解液樣本（0.1-1.0 mL），10 µL 适当稀释的抗体（参考产品说明书）。
2. 在 4 °C 下孵育 90 分钟至过夜，在适当的摇床上轻轻混匀样品。
3. 加入 50-100 µL 琼脂糖結合物懸浮液（約 25-50 µL 琼脂糖/床體積）。
4. 在 4 °C、3,000xg 下離心 2 分鐘，收集免疫沉淀複合物。
5. 用 1 ml 洗滌緩衝液重新懸浮清洗沉澱物，然後在 4 °C，以 3,000xg 離心 2 分鐘。重複此步驟至少 3 次。

SDS-PAGE製備

1. 將每個沉澱物重懸於 25-100 µL Laemmli 樣品緩衝液中，最終濃度為 1x 樣品緩衝液。在 95 °C 下加熱 5 分鐘。
2. 在室溫下 12,000xg 離心 30 秒。收集上清液（IP 樣品）。如果需要（在蛋白質穩定性允許的情況下），IP 樣品可以保存在 -70 °C 的樣品緩衝液中。
3. 在 SDS-PAGE 上運行已知濃度的樣品和 MW 標準（聚丙烯酰胺凝膠的適當百分比是根據蛋白質的分子大小而定的）。

材料

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參考資料

1. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. . Laboratory Press New York: Cold Spring Harbor.