信號肽優化：對重組單株抗體生產率、產品品質和抗原結合親和力的影響

Joaquina Mascarenhas, Dustin Davis, Pegah Jalili, Trissa Borgschulte, Kevin Ray, Henry J. George, Kevin J. Kayser, Nan Lin

摘要

信號肽是存在於分泌蛋白N-端的5-30個氨基酸(aa)的肽。已知信號肽對蛋白質分泌的效率和 N 端處理的正確性都有很大的影響。

在本研究中，我們評估了一種模型重組人源化 IgG 的兩種信號肽序列。使用 FACS 分析評估了在瞬間轉染和穩定（大量和迷你池）階段的產率。使用肽圖和完整質量分析評估 N 端裂解情況。觀察到 N 端異質性，其中一個信號肽導致主要物種的 D 質量 159 添加到輕鏈的 N 端。純化後的產品品質或抗原結合親和力都沒有受到影響。我們成功地使用了定點突變技術來重新設計信號肽，以防止這種誤解。然而，這會導致重組 IgG 的生產率降低，但不會影響產品的品質或生物活性。這結果強調了用平衡的優化策略評估更多信號肽設計的重要性，以確保正確的 N 端裂解和高生產率。

背景和方法

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圖 1. 信號肽的結構。

信號肽並非由嚴格的共識序列組成，而是具有三區設計，包括帶正電荷的 N 端區域 (n-region)、疏水的中央區域 (h-region) 以及中性、極性的 C 端區域 (c-region)。

材料和方法

細胞培養和Fed Batch Assay

轉染CHOZN^® GS -/-宿主細胞系，並產生表達模型人源化單克隆抗體的單細胞克隆。兩種不同的載體骨架：評估了 CLE 305 和 CLE 306。在第 4 天和第 7 天，用葡萄糖和谷氨酰胺或僅用葡萄糖補充。培養物維持在 Ex-CELL^® CHO CD Fusion (14365C)中。

完整蛋白精確質譜法

使用完整質量存取糖型的重組 IgG 總糖型分佈的相對值是使用 SEC-MS（Waters Acquity UPLC^®/Q-TOF Premier™）方法測定的。

分泌 IgG 的表面抗原染色和 FACS 分析

使用 PE 結合的 F(ab')2 片段 Donkey Anti-human IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc # 709-116-149）對瞬態或穩定轉換的細胞進行染色。

位點導向突變

設計並合成了包括對應於輕鏈上信號肽 C 端兩個氨基酸（蘇氨酸和甘氨酸）的 6 個碱基對缺失的片段。使用 QuikChange II XL Kit (Agilent, Cat#200521-5) 按照製造商的規程對 CLE 306 媒體進行定點突變。新的載體稱為 CLE 323。CLE 306 也重新克隆了輕鏈上的種系信號肽。

結果

在瞬間池和穩定池中確認表達

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圖 2. 使用 PE 結合抗體對分泌的 IgG 進行表面抗原染色，然後進行 FACS 分析。

在瞬間階段和在 -Glutamine 選擇下產生的穩定池中，確認了分泌抗體的表達。

圖 3. Code H HC 和 LC 的解卷 MS 圖譜。

HC峰與建議的HC序列一致，但C端Lys被截斷。

觀察到的 LC 顯示兩個峰，一個是預期大小的峰，另一個是 + Δmass 為 159 Da 的主要峰。這與信號序列 C 端胺基酸「ThrGly-」的質量相關。肽圖結果證實 HC 的 N 端處理正確，而 LC 有一個預期質量 + 159 的肽。

信號肽的正確處理工程

Engineering of Signal Peptide for Correct Processing

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圖 4. 使用定點突變技術從 LC 上的信號肽序列中刪除兩個 C 端 aa。Signal P 和 SIGCleave 軟體預測工程信號肽的處理過程正確無誤。

在胚芽系和工程信號肽中正確處理

表達向量

圖 5. Code H LC 的解卷积 MS 光谱。

左圖使用 LC 上的種系信號肽序列，右圖使用工程化版本 2 信號肽。

產品品質和抗原結合親和力

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圖 6. 純化重組 IgG 的 SDS-PAGE 變性凝膠。

左圖使用 LC 上的種系信號肽序列，右圖使用工程化的版本 2 信號肽。

Signal Pep+de Version	參考 KD (pM)
未修改 (CLE 306)	49。	Sample KD (pM)
Unmodified (CLE 306)	49.7	53。6
工程化 (CLE 323)	45.2	40.1
Germline (CLE 320)	45.2	42.2

對重組 IgG 產能的影響

圖 7. Minipool 靜態和餵料批次震盪培養滴定度

結論

• CLE 306 和 CLE 305 的輕鏈上的信號肽導致模型 IgG 的瞬間和穩定表達。
• 這個版本導致信號肽序列的誤切，造成
  -    + Δ質量159的主要峰
  -    ；此質量對應於裂解位點前的兩個氨基酸蘇氨酸 + 甘氨酸的質量
  -    沒有觀察到對產品質量的影響
• 輕鏈上的胚系信號肽（CLE 320）導致了正確的信號肽處理
• 重新製造信號肽，以定點突變去除兩個氨基酸 Threonine + Glycine，也可得到正確的信號肽處理
  -    產品品質或抗原結合親和力未見差異
  -   ；重新設計的信號肽生產率下降，在 minipool 靜態和和
       Fed 批次培養物中表達下降
• 結果強調了以平衡的優化策略評估更多信號肽設計的重要性，以確保正確的 N 端裂解和高生產率。

鳴謝

內部分析R&D：
Isil Yasa, Kevin Ray

CHOZN^® Platform Team  

材料

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