免疫沉澱技術

目標蛋白可透過免疫共沉淀（也稱為免疫定性或拉取技術）從粗細胞裂解液中分離和富集。首先在蛋白 A 膠質或蛋白 G 膠質層析介質上擷取具有特異性的抗體。在第二步中，固定化的抗體會被用來擷取和富集所感興趣的蛋白質（即抗原）。根據抗體的特異性，目標蛋白可被富集數百倍。結合其他技術（如 SDS-PAGE 和免疫印跡），免疫沉淀可用於檢測和量化抗原、測定相對分子重量、監測蛋白質的轉換和轉譯後修飾，以及檢查酶的活性。

利用蛋白 A 和蛋白 G 對各種哺乳類動物 IgG 分子 Fc 區域的高特異性，蛋白 A Sepharose 和蛋白 G Sepharose 色層析介質可有效、快速地分離和富集此類免疫複合物。

Cytiva 的免疫沉淀入门包（图 A3.1）是免疫沉淀工作的良好起点。該套件包括nProtein A Sepharose 4 Fast Flow (2 mL)和Protein G Sepharose 4 Fast Flow (2 mL)，可以處理多種抗體和選擇最佳培養基。

圖 A3.1. 免疫沉淀入门包，用于对具有不同结合选择性的多种抗体进行免疫沉淀。

Protein G Mag Sepharose 和 Protein A Mag Sepharose (圖 A3.2)結合了行之有效的富集方法與磁珠平台，具有小規模樣品製備的優異特性。配合 MagRack 6（一個可容納六個微離心管的分離工具），最多可同時處理六個樣品。另外，  Mag Rack Maxi 可處理高達 50 mL 的較大樣品容量。

圖 A3.2. Protein A 或 Protein G Mag Sepharose（左圖）透過使用 MagRack 6 或 MagRack Maxi（中圖和右圖），可在小量或大量樣品（低至微升至高至毫升量級）中簡單地富集目標蛋白質。

免疫沉淀的程序通常必须根据经验进行优化，才能获得满意的结果。例如，細胞裂解條件的選擇對於細胞類型和抗原的使用方式至關重要。沒有細胞壁的細胞（例如

參考 Table 3.1 in Chapter 3 to see which medium is likely to be suitable for the antibody source and subtype, or test using Immunoprecipitation Starter Pack.

细胞裂解条件

细胞裂解必须足够苛刻以释放目标抗原，但又足够温和以保持其免疫活性。一些常用的裂解緩衝液列於 表 A3.1.

NP-40（IGEPAL™ CA-630）和 RIPA 緩衝液可釋放大部分可溶性胞質或核蛋白而不釋放染色體 DNA，是初始實驗的好選擇。

影響抗原萃取的參數包括鹽濃度（0 至 1 M）、非離子去垢劑（0.1% 至 2%）、離子去垢劑（0.01% 至 0.5%）和 pH 值（6.0 至 9.0）。

表 A3.1 常見的裂解緩衝液

緩衝液和溶液	內容	破壞細胞的能力
分析緩衝液
低鹽	1% IGEPAL CA-630, 50 mM Tris, pH 8.0, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	+
NP-40 (IGEPAL CA-630)	150 mM 氯化鈉，1% IGEPAL CA-630, 50 mM Tris,  pH 8.0, 1 mM PMSF	++
RIPA	150 mM 氯化鈉, 1% IGEPAL CA-630, 0.5% 脱氧膽酸钠 (DOC), 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0, 1 mM PMSF	+++
高鹽	500 mM 鈉氯化物、1% IGEPAL CA-630, 50 mM Tris, pH 8.0, 1 mM PMSF	++++
Other buffers and solutions
PBS	1mM磷酸氫鉀，10mM磷酸氫二鈉，137mM氯化鈉，2.7 mM 氯化鉀，pH 7.4
洗滌緩衝液	50 mM Tris，pH 8.0
樣品緩衝液（還原）	1% SDS, 100 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 7.5

抗體的選擇

多克隆血清含有針對抗原多個表位的抗體。這些抗體有助於穩定抗原-抗體-介質複合物，但也可能在分析過程中產生高背景的問題。

單克隆抗體（MAbs）更具特異性，可減少背景，但由於抗原親和力較低，可能導致形成較不穩定的免疫複合物。使用不同的 MAbs 池可以克服這個問題。

圖 A3.3. Protein A HP SpinTrap 自旋柱和 Protein A HP MultiTrap 96 孔板，用於富集各種生物樣本中的蛋白質。

Cytiva蛋白A和G產品（Protein A HP SpinTrap、Protein G HP SpinTrap、Protein A HP MultiTrap和Protein G HP MultiTrap，以及Protein G和Protein A Mag Sepharose）專為小規模蛋白富集而設計，例如用於凝膠電泳、液相色譜和質譜分析的上游（圖A3.3）。

在交联方案中，抗原捕获抗体通过交联剂共价结合到蛋白A或蛋白G Sepharose层析介质上。

如果所需的蛋白/抗原的分子量與抗體的重鏈或輕鏈相似，導致 SDS-PAGE 分析中的共遷移問題，或抗體干擾下游分析，則使用交聯方案。

在經典的方案中，抗原擷取抗體是透過分別與蛋白A或蛋白G耦合到蛋白A或蛋白G Sepharose層析介質來固定。接著，結合的抗體會被用來擷取感興趣的抗原。

蛋白質富集的最佳參數取決於特定的抗體-抗原組合。每種特定的抗體抗原組合都需要進行優化，以獲得所需的結果。可能需要優化的參數包括樣品前處理、要富集的蛋白質量、孵育時間、緩衝液的選擇和洗滌次數。