Imprint^®染色质免疫沉淀试剂盒（CHP1）实验方案

产品描述

蛋白质-DNA相互作用对于信号传导、基因转录、染色体分离、DNA复制/重组以及表观遗传调控等细胞功能具有重要作用。染色质免疫沉淀（ChIP）²⁰技术为蛋白质-DNA相互作用体内研究提供了一种快速、可靠的方法。

我们Imprint染色质免疫沉淀试剂盒利用检测板系统，可实现快速的高通量ChIP检测。这种检测板方法限制了检测过程的灵敏度，因此，该试剂盒适用于表征高丰度的蛋白质-DNA事件，如组蛋白或RNA聚合酶II事件。该方案针对从100,000-250,000个细胞/ ChIP反应/孔中分离的染色质进行了优化。增加每孔中的细胞，可能会增强非特异性背景结合并减少靶标富集。

Imprint ChIP操作步骤适用于高丰度的已知蛋白质-DNA相互作用的动力学或药物筛选研究。^{13, 14} 该操作步骤采用一种简化方法，先从哺乳动物细胞或组织的交联开始，然后进行染色质分离。随后，在抗体包被的微孔中剪切并捕获染色质、逆转交联并使用纯化柱分离DNA。

CHP1试剂盒可在一天内对哺乳细胞或组织的DNA完成免疫沉淀和分离，速度快于任何其他商业试剂盒。该试剂盒包括小鼠IgG、抗RNA聚合酶II以及人GAPDH引物，作为阴性和阳性对照。所得DNA适用于从单靶标鉴定到全基因组图谱分析技术的各种下游应用。此外，经优化的GenomePlex全基因组扩增（WGA）方法可用于扩增ChIP DNA。^{15, 16, 18}

试剂盒组件

试剂描述	货号	24 Rxn	96 Rxn
IP洗涤液	W4767	30 mL	120 mL
抗体缓冲液	A4356	17.5 mL	70 mL
胞核制备缓冲液	N2663	6 mL	24 mL
匀浆缓冲液	H8039	10 mL	40 mL
剪切缓冲液	S3697	3 mL	12 mL
稀释液	D8943	3 mL	11 mL
逆转液D	R1655	0.2mL	4.5mL
DNA解离液	D9068	1.2 mL	4.5 mL
纯化柱制备液	C2112	15 mL	60 mL
结合液	B7556	11 mL	50 mL
浓缩洗涤液	W3637	3 mL	12 mL
洗脱液	E7777	1.5 mL	8 mL
GenElute™结合柱G	C6863	各25	各100
收集管，2 mL	T7813 或 T5449	各50	各200
蛋白酶抑制剂混合物，1 X 1ML	P8340	0.05 mL	125 µL
正常小鼠IgG（1 mg/mL）	M8695	15 µL	50 µL
抗RNA聚合酶II (1 mg/mL)	R1530	10 µL	40 µL
蛋白酶K（>800 U/mL）	P4850	50 µL	125 µL
正向对照引物（GAPDH）（20 mM）	F3430	25 µL	100 µL
反向对照引物（GAPDH）（20 mM）	R2280	25 µL	100 µL
检测联孔	S6447	各3	12个一装
8孔联盖	S6572	各3	12个一装

储存方法/稳定性

• 抗体、蛋白酶抑制剂混合物和引物保存在–20 °C。
• 检测联孔和蛋白酶K保存在2–8 °C。
• 所有其他组分可保存在室温条件下。

工作流程

制备说明

优化样品的剪切条件：
制备剪切染色质所使用的设备和样品类型可能对于实验的成败具有重要影响。CHP1试剂盒针对已知的蛋白质-DNA事件而设计，因此增加了少量试剂以供优化使用。另外，还额外提供了细胞核制备缓冲液、匀浆缓冲液和剪切缓冲液供4个样品优化使用。有关更多信息，参阅故障排除指南。

超声处理法已针对每个细胞系和仪器进行了优化。我们建议使用Diagenode Biodisruptor（水浸超声），以实现可重复的超声处理。良好的起始点为在高“H”档位以
30秒“开/ON”和30秒“关/OFF”循环超声5、10和15分钟。

跑胶检查超声结果：
i)使用10 µL样品并加入40 µL H₂O ii)加入2 µL的5 M NaCl（终浓度为0.2 M NaCl）逆转交联。 iii)煮沸15分钟。 iv)恢复至室温后，加入1 µL 10 mg/mL RNase A并在37 °C孵育10分钟 v)使用GenElute PCR Clean-Up Kit（NA1020）纯化和分离DNA。 vi)在凝胶上上样1和4 µL超声DNA并确定条带大小。 vii) DNA条带在200 bp至1 kb之间且峰值出现在500 bp（2-3个核小体）左右的超声条件应被用于ChIP反应。

充分混匀试剂。检查试剂是否含有沉淀物。如有任何试剂形成沉淀，应在55 °C温育至沉淀溶解。使用前，使试剂恢复至室温。

洗涤液：使用12 mL（24次反应）或44 mL（96次反应）乙醇（无水，分子生物学级别）稀释浓缩洗涤液。每次使用后，拧紧稀释洗涤液的瓶盖以防止乙醇挥发。

1.25 M甘氨酸：制备1.25 M甘氨酸储液。在不使用时，保存在2-8 °C。6个月后，应重新制备新储液。

65 °C培养箱：将水浴器、培养箱或杂交箱预热至65 °C。

操作流程

I. 抗体与检测孔结合

1. 确定所需的Stripwells数量并将其留在框内。将未使用的Stripwells放回袋中，密封并保存在2-8 °C。使用150 µL抗体缓冲液洗涤Stripwells一次。
   注意：为获得最高灵敏度和最低背景，所有孵育和洗涤应采用推荐时间范围的最大值。对于某些一抗，在实验方案中使用Tris缓冲生理盐水（含BSA，pH 8.0，T6789，自备）代替抗体缓冲液（A4356），可降低背景。在某些情况下，这可以提高灵敏度。
2. 每孔加入100 µL抗体缓冲液。 然后，加入1 µg抗体：1 µL正常小鼠IgG作为阴性对照，1 µL抗RNA聚合酶II作为阳性对照，加入1-4 µg各目标抗体（最多10μL抗体）。
   注意：注：该方案通常建议每孔使用1μg抗体。但是，当使用尚未经过ChIP验证的抗体时，可能需要优化抗体用量。有些抗体可能永远不适用于ChIP，因为交联可能对Fab与其表位的相互作用产生不利影响。
3. 使用封口膜或粘性封板膜覆盖Stripwells，并在室温环境中使用轨道摇床以50-100 RPM振动60-90分钟。同时，按下一步所述方法制备样品提取物。（II.A适用于细胞培养，II.B适用于组织）。

II.A.细胞培养样品制备

1. 建议每个ChIP样品检测孔加入1-25 x 10⁴个细胞，例如，每个ChIP检测孔使用2 x 10⁵个细胞，则8个ChIP检测孔应准备1.6 x 10⁶个细胞。
   对于单层或贴壁细胞：
   用胰蛋白酶短暂消化细胞并收集至15 mL锥形管中。或者，使用以下第3步所述的交联溶液将细胞直接固定在培养瓶中。按以下第4步所述方法使用甘氨酸淬灭。使用细胞刮刀在冰上收集细胞。使用血细胞计数仪计数细胞。
   对于悬浮细胞：
   将细胞收集到15 mL锥形管中。使用血细胞计数仪计数细胞。
2. 将细胞以约180 x g离心5分钟，弃去上清液。使用10 mL PBS，通过离心清洗细胞一次。
3. 将细胞重悬于9 mL新鲜培养基中。向样品中加入270 µL 37%甲醛，然后立即颠倒样品管多次。最终的交联溶液为1%甲醛。在室温环境中在摇床上孵育10分钟。
4. 向每9 mL交联溶液中加入1 mL 1.25 M甘氨酸进行淬灭，混匀并以约180 x g离心5分钟。取出培养基并使用10 mL冰冷的PBS通过离心清洗细胞3次。
5. 加入细胞核制备缓冲液以重悬细胞沉淀（贴壁细胞使用200 µL/10⁶个细胞，最少50 µL；悬浮细胞为100 µL/10⁶个细胞）。将细胞悬液转移至1.5 mL样品管中，并在冰上孵育10分钟。剧烈涡旋振荡10秒并以约180 x g离心5分钟。
6. 小心取出上清液并将细胞核沉淀重悬于含蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的剪切缓冲液（100 µL/106个细胞）
   （10 µL PIC/1 mL剪切缓冲液）中。每个用于超声处理的样品管中最少加入50 µL样品，最多500 µL。将样品置于冰上孵育10分钟，偶尔涡旋振荡一下。
7. 在冰上通过超声处理剪切DNA。必须根据所用的特定细胞、体积和设备优化超声条件。试剂盒额外提供了可供约4个样品优化使用的剪切缓冲液。通过标准琼脂糖电泳分析5 µL的逆转交联DNA。剪切DNA的大小应在约200-1000 bp之间。有关更多信息，参阅故障排除指南。
8. 以14,000 rpm离心10分钟，使细胞碎片沉淀。
9. 将澄清的上清液转移至1.5 mL样品管中。这一步所得的上清液可保存在–70 °C。继续进行第III节Protein/DNA免疫沉淀。

II.B.组织样品制备

1. 将组织样本放入60 mm或100 mm的培养板中。去除不需要的组织，如脂肪和坏死材料。使用干净的手术刀或刀片称取样品并将样品切成最小的碎块。每个检测孔使用10-20 mg组织（RNA Pol II的ChIP可低至1mg /孔）。
2. 将组织碎块转移到15 mL锥形管中。向培养基中加入甲醛（每9 mL加入270 µL 37%甲醛，终浓度为1%），制备交联溶液。向每40 mg组织中加入1 mL交联溶液。在室温环境中在摇床上孵育15-20分钟。
3. 向每9 mL交联溶液中加入1 mL 1.25 M甘氨酸，混匀并以约220 x g离心5分钟。弃去上清液。使用10 mL冰冷的PBS清洗组织三次，每次以约220 x g离心5分钟。弃去上清液。
4. 将组织碎片转移至Dounce匀浆器。向每200 mg组织中加入1 mL匀浆缓冲液，通过10-20次匀浆分解组织碎块。
5. 将匀浆混合物转移至1.5 mL样品管（每管最多500 µL）中，并在4 °C以约960 x g离心5分钟。弃去上清液。
6. 加入含蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的剪切缓冲液，100 µL/20 mg组织。（10 µL PIC/1 ml剪切缓冲液）。在冰上孵育10分钟，偶尔涡旋振荡一次。
7. 超声剪切DNA。必须根据所用的特定组织和设备优化超声条件。试剂盒额外提供了可供约4个样品优化使用的剪切缓冲液。取出5 µL超声裂解液，逆转交联并纯化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。剪切DNA的大小应约为200-1000 bp。参见故障排除指南。
8. 在4 °C以21,000 x g离心10分钟，使细胞碎片沉淀。
9. 将澄清的上清液转移至1.5 mL样品管中。这一步所得的上清液可保存在–70 °C。继续进行第III节Protein/DNA免疫沉淀。

III.蛋白/DNA免疫沉淀

1. 将上述第9步所得澄清上清液与稀释缓冲液按1:1混合，即50 µL超声染色质 + 50 µL稀释缓冲液。
2. 取出5 µL稀释上清液并放在冰上，作为Input（5%）对照管。
3. 取出孵育的抗体溶液。
4. 使用150 µL抗体缓冲液，通过移液枪上下吹打，清洗检测孔3次。向每孔中加入100 µL（或使终体积达到100 µL所需的量）稀释上清液。用封口膜或粘性封板膜覆盖检测孔，并在室温环境中使用轨道摇床振动60-90分钟（50-100 rpm）。
5. 取出上清液。
6. 使用150 µL IP洗涤液清洗检测孔6次，每次2分钟。为获得最佳结果，通过倒置检测孔并在吸收性材料上叩击以弃去洗涤液。
7. 使用150 µL的1x Tris-EDTA缓冲液清洗检测孔1次。继续进行第IV节交联逆转。

IV.交联逆转

1. 在Input对照管和每个样品孔中加入40 µL含蛋白酶K的DNA解离液（1 µL蛋白酶K/40 µL DNA解离液）。吹打混匀。
2. 用Stripcaps密封样品孔。将样品孔和Input对照管置于65 °C的水浴或杂交箱中孵育15分钟。
3. 向样品（以及Input对照管）中加入40 µL逆转液。混匀，再次密封，并在65 °C孵育90分钟。继续进行第V节DNA纯化。

V. DNA纯化

1. 将GenElute结合柱G放在收集管中。加入500 µL纯化柱制备液，平衡纯化柱。将纯化柱以约12,000 x g离心1分钟，去除所有流经液体。所有后续离心应采用≥ 12,000 x g的转速。
2. 在一个单独样品管中，加入400 µL结合液和ChIP裂解液，然后短暂涡旋。将混合液转移至经平衡的结合柱上。离心1分钟，去除所有流经液体。
3. 向每个纯化柱中加入500 µL稀释的浓缩洗涤液。离心1分钟，去除所有流经液体。将纯化柱再离心2分钟，使其彻底干燥。
4. 将纯化柱转移至新的收集管中。直接向纯化柱的膜上加入15-50 µL洗脱液；孵育至少1分钟。
5. 离心1分钟。为完全回收，将洗脱物重新加到纯化柱上，并再次离心。现在，所得DNA可立即用于下游应用或保存在–20 °C。
   注：如果您计划使用现有的GenomePlex方法学扩增样品，为获得最高的洗脱物浓度，建议使用15-20 µL洗脱。

分析方法

ChIP DNA的定量
从ChIP反应中获得的模板量取决于多种因素：细胞数量和类型、处理方法、超声剪切获得的模板长度等。通常，通过简单的分光光度（A₂₆₀）读数无法准确定量样品浓度。采用以下两种推荐方法，有可能解决这种次要的技术难题。

1. 荧光定量：
   Quant-iT™ dsDNA Assay Kit高灵敏度试剂盒（Invitrogen）利用范围为0.2-10 ng/孔的标准曲线，可对大部分ChIP样品进行准确定量。但是，有些靶标可能因浓度过低而无法通过该方法进行准确定量。
2. 定量PCR（qPCR）
   该方法需要了解与目标免疫沉淀蛋白质发生相互作用的基因组位点以及与目标免疫沉淀蛋白质完全解离的基因位点。利用这两个位点的特异性引物，可通过比较样品中两种引物的循环阈值（Ct），实现相对和/或绝对（已知量超声剪切gDNA的标准曲线）定量。

PCR条件（已提供引物集）
如果采用传统PCR或qPCR方法，则可以使用试剂盒提供的对照人GAPDH引物作为人源材料的阳性对照
（246 bp扩增子）。如果使用SYBR^® Green JumpStart Taq ReadyMix™（S4438），则使用以下循环参数：

hGAPDH正向引物caattccccatctcagtcgt
hGAPDH反向引物tagtagccgggccctacttt

1 次循环	95 °C	2 min
40 次循环	95 °C	30 s
	58 °C	30 s
	72 °C	30 s

其他来源的ChIP材料将需要由用户设计的对照引物。传统PCR的循环数也需要由用户优化。

扩增（可选）
在ChIP之后，只有几纳克的模板可供下游应用使用。扩增该模板可扩大全基因组分析的数量和范围。

GenomePlex全基因组扩增（WGA）已被证明是一种有效的ChIP DNA扩增方法。^{15, 16, 18} 该试剂盒利用基于基因组DNA初始切口的专利扩增技术来扩增模板，以用于后续的独特双功能引物的杂交。引物的一个功能是对整个基因组中大约每500bp区域进行代表性退火。退火后，相邻模板被扩展以创建PCR可扩增的OmniPlex^®片段，其侧翼为通用引发位点，从而创建一个代表整个基因组的文库。随后，使用与初始引物序列互补的通用寡核苷酸引物对OmniPlex文库进行PCR扩增，这是WGA引物的第二个功能。

GenomePlex全基因组扩增（WGA）试剂盒被推荐用于¹⁸扩增免疫沉淀的DNA，并作以下修饰。

1. 向1 µL裂解缓冲液（F4304）中加入10 µL ChIP洗脱物，但无需在95 °C加热4分钟。继续进行文库制备。
2. 在扩增过程中另外增加6个循环，以94 °C加热15秒和65 °C加热5分钟的条件共循环20次。
3. 如果纯化后的总WGA产量低于3 µg，则使用GenomePlex WGA再扩增试剂盒（WGA3）对10 µL纯化WGA产物再次扩增。¹⁵

故障排除指南

观测结果	原因	建议解决方案
PCR产物很少或无PCR产物	细胞数量或组织量不足	先扩增ChIP DNA（WGA2/WGA4 试剂盒）再进行q-PCR，或使用基于ChIP检测的其他更大型微珠。
	未达到最佳的交联效果	确定交联时长，对5-20分钟范围进行评估。
	细胞或组织裂解不充分	利用显微镜观察5 µL裂解物，检查裂解效率。
	未达到最佳的超声处理效果	通过改变超声爆发的数量和长度来优化超声条件。在超声过程中，应避免起泡并保持样品放在冰上。大体积和/或单管内样品过多，会导致低效率的DNA裂解。
	抗体未与目标蛋白结合	检查抗体的亚类或同种型是否正确。选择一种经过ChIP应用检验的抗体。可识别天然蛋白质构象的抗体具有最高的成功率，即经过免疫沉淀检验的抗体。
	温度错误或DNA释放和交联逆转不充分	利用不同长短的交联时间，可能在DNA释放和交联逆转步骤需要不同的孵育时间。
	PCR条件错误	使用来自相似样品的纯化基因组DNA，优化PCR条件。
	引物设计不佳	确保使用目标序列的特异性引物。
	DNA洗脱物含乙醇	在加入洗脱液之前，应确保在DNA纯化过程中经过清洗后的纯化柱是完全干燥的。
	超声条件苛刻	必须优化超声处理过程，以确定合适的剪切条件。超声温度高、时间过长、强度过高都可能破坏蛋白质-DNA复合物。应始终在冰上超声，并在保证获得合适大小的剪切DNA（约200-1000 bp）的前提下尽可能降低超声强度和缩短超声时间。
阳性和阴性对照的扩增差异很小或无扩增差异	洗涤不充分	遵循实验方案，确保充分去除非特异性DNA-蛋白质复合物。
	PCR循环数过多	通过每次减少约3个循环去除少量反应和凝胶电泳分析，确定PCR循环数。仍处于对数阶段的最小循环数将产生最佳结果。
	非特异性DNA结合过多	根据“实验方案第I节第1步备注”部分所述的“最高灵敏度和最低背景”，使用Tris缓冲生理盐水（含BSA，pH 8.0，货号T6789，自备）代替抗体缓冲液。
	蛋白质-DNA靶标过少而无法检测	该试剂盒专为使用104-105个细胞即可检测到的高丰度事件而设计。稀有事件通常需要更多的捕获；在这种情况下，建议使用微珠补货系统。

常问问题解答

细胞数量能否增加？本试剂盒可使用的最大和最小细胞数是多少？

该试剂盒适用的细胞数范围为0.2–2.5 x 10⁵/孔/ChIP样品。若每孔细胞数超过50万，将增加非特异性结合并降低ChIP反应的得率和特异性。如果下游应用（ChIP-Seq.、ChIP-chip）需要更高的ChIP DNA得率：a) 对多个单独的ChIP反应进行连续洗脱（用50 µL洗脱缓冲液）并将洗脱的DNA合并；或b) 选择一种全基因组扩增试剂盒（WGA2或WGA4）扩增DNA。

如果超声处理不起作用，试剂盒是否与裂解酶兼容？是的，也可以通过酶（微球菌核酸酶，MNase）消化（试剂盒中未提供的试剂/方案）得到剪切染色质。用户必须根据所用细胞系优化MNase处理的用量、温度和持续时间。

这个试剂盒能和植物一起使用吗？爬行动物细胞呢？

适用，该试剂盒可用于来自植物或爬虫类动物细胞的超声剪切染色质，前提是用户具有交联和制备合适大小的超声剪切染色质的优化条件。

ChIP后分析如何分析qPCR数据?
如何计算“% Input”和“富集倍数”？

ChIP-qPCR数据分析（ΔΔCt方法）^17,19

i. 使用相同qPCR检测的Input DNA组分Ct值（ΔCt）对每个ChIP DNA组分的Ct值进行归一化，以排除染色质样品制备差异的干扰。

ΔCt [归一化ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] - Log₂ (Input稀释系数)))
其中，Input稀释系数=(input染色质百分比)^-1默认Input百分比为1%，即稀释系数100或6.644个循环（即100的log₂）。因此，从1% Input样品的Ct值中减去6.644，如上述方程所述。

计算重复样品的平均均一化ChIP Ct值。

ii.计算每个ChIP组分的% Input（均一化ChIP ΔCt的线性转换）。

% Input = 2 ^{(-ΔCt [均一化ChIP])}

iii.用均一化ChIP组分Ct值减去均一化背景[非特异性(NS)抗体]组分Ct值（第一个ΔΔCt）

ΔΔCt [ChIP/NS] = ΔCt [均一化ChIP] - ΔCt [均一化NS]

iv.计算样品特异性背景下的检测位点IP富集倍数（Assay Site IP Fold Enrichment）（第一个ΔΔCt的线性转换）。

富集倍数 = 2 ^{(-ΔΔCt [ChIP/NIS])}

Bioruptor为Diagenode SA商标。
GenomePlex和OmniPlex 为Rubicon Genomics, Inc的注册商标。
Quant-iT为Invitrogen的商标。
SYBR为Molecular Probes, Inc的注册商标。
Parafilm为American Can Co的注册商标。

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