使用 Cytiva 產品（GST 融合蛋白）進行分離

Glutathione S-transferase (GST) 是最常用的標記之一，用於促進重組蛋白的純化和檢測，有一系列產品可用於簡單的一步純化 GST 融合蛋白（請參閱純化選項）。

GST標記蛋白的純化和檢測，以及融合蛋白以包涵體形式表達時如何處理的資訊，在 GST基因融合系統手冊 和 重組蛋白手冊中有深入的論述：蛋白質擴增和簡易純化，可向 Cytiva 購買。

淨化選項

	結合能力	最大操作流量	備註
400 µg/column	n.a.	即開即用、預先包裝的色譜柱、緩衝液和化學品。與 MicroPlex™ 24 Vacuum 搭配使用時，具有高通量 (最多可同時處理 48 個樣品)。
GSTrap FF 1 ml	10-12 mg 重組 GST/色譜柱	4 ml/min	預製色譜柱，即可使用。
GSTrap FF 5 ml	50-60 mg 重組 GST/色譜柱	15 ml/min	製備好的色譜柱，即可使用。
GSTPrep FF 16/10	>；200 mg 重組 GST/色譜柱	10 ml/min	預製色譜柱，即開即用。
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow	10-12 mg 重組 GST/ml 培養基	450 cm/h*	用於包裝高效能色譜柱，以配合純化系統及擴展使用。
8 mg 馬肝 GST/ml 培養基	75cm/h*	用於包裝小柱和其他格式。

* 請參閱附錄 4，將線性流量 (cm/h) 轉換為體積流量。最大工作流量是在床高 10 cm、內孔距 5 cm 的填料柱中測量計算出來的。

純化範例

圖 22顯示在 GSTrap FF 1 ml 上純化 GST 融合蛋白的典型過程，以及純化蛋白的 SDS-PAGE 分析。

圖 22. GST 融合蛋白的純化。

Figure 23展示了 GST 融合蛋白的純化如何從 GSTrap FF 1 ml 試劑柱擴大 20 倍至 GSTPrep FF 16/10 試劑柱。

圖 23. 擴大 GST 融合蛋白的純化。

進行分離

結合緩衝液：140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.3

洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl、10 mM 還原型穀胱甘肽，pH 8.0

圖 24. 用注射器使用 GSTrap FF。 A：準備緩衝液和樣品。B：平衡色譜柱，載入樣品並開始收集馏分。 C：清洗和洗脫，繼續收集馏分。

1. 用5-10柱容量的結合緩衝液平衡色譜柱。
2. 用 5-10 個柱容量的結合緩衝液洗滌。

由於 GST 與穀胱甘肽之間的結合動力學相對緩慢，因此在上樣和洗脫過程中保持低流速非常重要。結合能力取決於蛋白質，因此產率會因蛋白質類型而異。

對於少量產品的單次純化或高通量篩選，GST MicroSpin 膠柱可與離心法或 MicroPlex 24 真空法配合使用，方便簡單。

若要增加容量，請串聯幾支 GSTrap FF 色譜柱（1 ml 或 5 ml）。如需更大容量，請使用 GSTPrep 16/10 FF 色譜柱或將 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 包裝到合適的色譜柱（見附錄 3, Column packing and preparation for affinity chromatography)。GSTrap FF 色谱柱可与注射器、蠕动泵或色谱系统配合使用。

通常包含酶特定识别位点，以便在需要时通过酶裂解去除 GST 标记。凝血酶通常用於酵素裂解，其後必須從重組產品中移除。HiTrap 苄脒 FF（高次）1 ml 或 5 ml 色谱柱为这一过程提供了简单、现成的解决方案（参见第 54 页， Purifcation or removal of serine proteases, e.g. thrombin and trypsin, and zymogens).

GSTrap FF 的重复使用取决于样品的性质。為了防止交叉污染，色譜柱只能用相同的樣品重複使用。

清洗

這些步驟適用於 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 和 Glutathione Sepharose 4B。

1. 用 2-3 柱容量的高 pH 值（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5）和低 pH 值（0.1 M 醋酸鈉，0.5 M NaCl，pH 4.5）缓冲液。
2. 重复循环 3 次。
3. 立即用 3-5 柱体积的结合缓冲液重新平衡。

如果培養基失去結合能力，可能是由於沉澱的蛋白質、變性蛋白質或非特異性結合蛋白質的堆積。

立即用 5 柱容量的結合緩衝液清洗。

去除疏水性結合物質：

1. 用 3-4 柱容量的 70% 乙醇（或 2 柱容量的非離子洗滌劑 (Triton™ X-100 1%) ）清洗。
2. 立即用 5 柱容量的結合緩衝液清洗。

媒體特性

	墊臂	配體和密度	pH穩定度*	平均粒徑
谷胱甘肽分離膠 4 Fast Flow (GSTrap FF, GSTPrep FF 16/10)	10 碳鏈結	短期 3-12 長期 3-12	90 µm
Glutathione Sepharose 4B	10 carbon linker	短期 4-13 長期 4-13	90 µm

化學穩定性

在室溫下暴露於 0.1 M 檸檬酸鹽 (pH4.0)、0.1 M NaOH、70% 乙醇或 6 M 鹽酸胍中 2 小時，結合能力無明顯損失。

儲存

在中性pH值下，用20%乙醇清洗培養基和色譜柱（使用約5個色譜柱容量來包裝培養基），並儲存於+4至+8 °C.

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